امروزه علاقه مردم به غذاهاي عاري از مواد شـيميايي افزايش يافتـه اسـت. ايـن موضـوع اهميـت اسـتفاده از كشت هاي ميكروبي محافظت كننـده را نشـان مـيدهـد. اصــــطلاح Biopreservation بــــه كنتــــرل يــــك ميكروارگانيسـم توسـط ميكروارگانيسـم ديگـر اطـلاق مي گردد كه در سال هاي اخير اهميت زيادي پيـدا كـرده اسـت . نگـهدارنـده هـاي بيولوژيكي مدت زمان ماندگاري را طولاني تر ميكننـد وسلامتي غذا را به خاطر فلور ميكروبي طبيعي يا تكميلي و محصولات ضد ميكروبي بهبود ميبخشند. واكنش بين قارچ هـاي مولـد توكسين و ديگر ميكروارگانيسم ها يك پديده معمول در طبيعــت اســت كــه مــيتوانــد رشــد قــارچ و توليــد مايكوتوكسين ها را تحت تاثير قرار دهـد . باكتري هاي مولد اسيدلاكتيك با توليد چندين تركيـب ضد ميكروبي قادرند ميكروارگانيسم هاي پاتوژن و مولـد فساد را در مواد غذايي كنترل كننـد. اسـتفاده از بـاكتري هاي مولد اسيدلاكتيك براي كنترل رشد كپك ها ميتواند يك جايگزين مناسب براي نگهدارنده هاي شيميايي باشد كه علاوه بر توليد مواد ضد قارچي، ميتوانند نقش مثبتي در طعـم، بافـت و ارزش تغذيـه اي غـذا داشـته باشـند.
آنچه در این مطلب می‌خوانید:
اثر ضدكپكی باكتري هاي اسيدلاكتيك
روشهاي آزمايشگاهي مختلفي براي بررسي اثر ضدكپكي باكتري هاي مولد اسيدلاكتيك ابداع شده است كه بيشـتر آنهـا در سـطح محيط كشت اين اثرات را بررسي ميكنند. اما به دليل تركيبات موجود در غذا و پيچيدگي روابط اجزاي آن در بسياري مـوارد ممكـن است اثرات ديده شده در محيط كشت، در غذاي واقعي ديده نشود.
پژوهش هاي مختلف در اين رابطه بيشـتر ظـاهر نشـدن كپـك در سطح مواد غذايي را معياري براي خاصيت ضد كپكي ميكروارگانيسم هاي درون غذا دانسته اند. از ايـن رو ابـداع و مقايسـه روش هـاي كارآمد جهت بررسي خاصيت ضد كپكي باكتري هاي مولد اسيدلاكتيك در مواد غذايي مفيد ميباشد. ما در این مقاله به بررسی، معرفي و مقايسه روشهاي اندازه گيري خواص ضدكپكی باكتري هاي لاكتيکی در پنير می‌پردازیم.
كاهش خطرات تهديد كننده سلامتي
گزارش هايي مبني بر كنترل رشـد ميكروارگانيسـم هـا و افــزايش زمــان نگــهداري توســط بــاكتري هــاي مولــد اسيدلاكتيك در محصولات تخميري ارائه شده است كـه نشان دهنده كاهش خطرات تهديد كننده سلامتي توسط مايكوتوكسين ها ميباشد. جهت انتخاب باكتري هاي مولد اسيدلاكتيك به عنوان يك نگهدارنده بيولوژيكي، در ابتـدا مـي بايسـت اثـرات آنهـا را بـر عليـه ميكروارگانيسـم هـاي مـورد نظـر در محصـولات غـذايي هـدف، بررسـي نمـود. روش هـاي آزمايشگاهي مختلفـي بـراي بررسـي اثـر ضـد ميكروبي باكتري هاي مولد اسيدلاكتيك ابداع شده است كه بيشـتر آنهـا در سـطح محـيط كشـت ايـن اثـرات را بررسـي ميكنند. اين در حالي است كه به دليل تركيبات موجـود در غذا و پيچيدگي روابط بين اجزاي آن در بسـياري از موارد ممكن است اثرات ديده شده در محيط كشت، درغذاي واقعي ديده نشود.
باكتري های مولد اسـيدلاكتيك بـه عنوان يك نگهدارنده بيولوژيكی
در مورد استفاده از باكتري هاي مولد اسـيدلاكتيك بـه عنوان يك نگهدارنده بيولوژيكي جهت مهار آلودگي هاي باكتريايي، شمارش اختصاصي باكتري هـاي آلـوده كننـده يـك معيـار مناسـب جهـت تعيـين ميـزان مهاركننـد گي باكتري هاي مولد اسيدلاكتيك بـر عليـه ايـن بـاكتريهـا است و در پژوهش هاي گوناگون بـه عنـوان يـك روش معمول و كارآمد مورد استفاده قرار ميگيـرد .
ارزيابي ميزان رشـد
از آنجايي كه كپك ها براي تكثير توليد اسپور ميكنند، لذا امكان ارزيابي ميزان رشـد آنهـا از طريـق شـمارش تعداد امكان پذير نمي باشد و جهت بررسي ميـزان رشـد يا مهار رشد كپك ها در مواد غذايي مي بايست به دنبـال روش هــايي غيــر از شــمارش بــود. در ايــن رابطــه، پژوهش هاي مختلف عمـدتاً رشـد مسـتقيم كپـك را در سطح مواد غذايي مد نظر قرار داده و عدم ظهور پرگنـه كپك در سطح مواد غـذايي را معيـاري بـراي خاصـيت ضـد كپكي ميكروارگانيسـم هـاي درون غـذا دانسـته انـد.
از ايــن رو ابــداع و مقايســه روش هايي كارآمد جهـت بررسـي خاصـيت ضـد كپكي باكتري هـاي مولـد اسـيد لاكتيك در مـواد غـذايي مفيـد ميباشد.
اثـرات ضـد كپكی
در ايـن تحقيـق از بـاكتري هـای مولـد اسـيدلاكتيك توليد كننده مواد ضد قارچي در توليد پنير سـفيد اسـتفاده شد و با استفاده از روشهاي مختلف اثـرات ضـد كپكي آنها در پنيرهاي توليدي مورد بررسي قرار گرفت تا بـا مقايسه نتايج به دست آمده بتوان ويژگي اين آزمونها را مشخص كـرد و بـا مقايسـه آنهـا، كارآمـدي و مـوارد استفاده هر كدام را بررسي نمود.
روش تحقیق
روش تهيه توليد پنير
جهت تهيه مخلـوط اوليـه بـراي توليـد پنيـر از ۱۱/۲ درصد شيرخشك، ۱۰درصـد كنسـانتره پـروتئين شـير، ۳/۵درصد كنسانتره پروتئين آب پنير، ۱۴درصـد پـودر خامه ۵۹درصد چربي ( شركت پگاه فارس ) و ۲درصـد نمــك اســتفاده شــد. ســپس آب بــا دمــاي ۳۵ درجــه سلسيوس به مخلوط پودرهاي مورد نظر افزوده شد و به منظور هيدراته شدن پودرها، بـه مخلـوط يـك سـاعت زمان داده شد. سپس فرآيند همگن سازي در فشـار ۱۵۰ بار و دماي ۵۰ درجـه سلسـيوس و پاستوريزاسـيون در دماي ۷۰درجه سلسيوس و زمان ۳۰دقيقه اعمال شـد. پس از آن مخلوط تا دماي ۳۰درجه سلسيوس به منظور تلقيح باكتري هاي مولد اسيدلاكتيك و يـا اسـتارتر سـرد گرديد.
از باكتري هاي مولد اسيدلاكتيك كه در تحقيق ديگري از منابع طبيعي جدا و خـالص سـازي شـده و خـواص ضد كپكي آنها در سطح محيط كشت اثبات شـده بـود، در توليد پنير اسـتفاده شـد. ايـن بـاكتريهـا شـامل، .L L. casei ،L. plantarum CAG ،plantarum PIN L. plantarum ، L. pentosus H ،D L. plantarum KU 13 ،NBRC107151 بودنــــد.
بـاكتريهـاي مولـد اسـيدلاكتيك بـا تعداد ۸ واحد لگاريتمي (۸ log cfu/g) در هر گـرم و( بـهChristian-Hansen, Denmark) R-704 اسـتارتر ميزان ۱گرم در ۱۰۰ كيلوگرم اضافه شد. پس از تلقـيح بـاكتري هـا و اسـتارتر، نمونـه هـا در دمـاي ۳۰درجـه سلسيوس تا رسيدن به pH برابر با ۵/۶ زمـان نگـهداري گرديد. در ادامه رنين به ميزان ۲گـرم در ۱۰۰ كيلـوگرم اضافه شد و براي تكميل انعقـاد، پنيـرهـا بـه مـدت ۳۰ دقيقه در دمـاي ۳۷ درجـه سلسـيوس قـرار گرفتنـد. در نهايت در دماي ۳۰درجه سلسيوس و تا رسيدن بـه pH حدود ۴/۸تا ۵ گرمخانه گذاري گرديد.
تهيه سوسپانسيون اسپور كپك
در اين تحقيق اثر باكتري هاي مولـد اسـيدلاكتيك بـر (PTCC 5004) A. flavus PTCC 5004 روي دو كپـك مركزPTCC 5286) A. parasiticus PTCC 5286 و كلكسيون قارچ ها و باكتري هاي صنعتي ايـران) بررسـي شد. جهت آماده سازي و تهيه سوسپانسيون حاوي تعداد مشخص كپك، ابتدا كپك هـاي مـورد نظـر روي محـيط در لوله آزمـايش و Malt extract Agar (MEA) كشت به صورت مورب كشت داده شد. لوله هاي محتوي كپك در دماي ۳۰ درجه سلسـيوس و بـه مـدت ۴ تـا ۷ روز گرمخانه گذاري شدند. پـس از ايـن مـدت در هـر لولـه سوسپانسيوني از اسپورهاي كپك بـا آب مقطـر اسـتريل تهيه شد. سوسپانسيون توليدي به لوله اسـتريل ديگـري منتقل شد و به منظور جدا شدن اسپورهـاي توليـدي از هم، به مدت ۵ دقيقه مخلوط گرديد. سپس با استفاده از لام هموسايتومتر زيـر ميكروسـكوپ بـا بزرگنمـايي ۴۰ شمارش اسـپور انجـام شـد. در نهايـت ميـزان آب لازم جهـت رقيـق سـازي سوسپانسـيون اوليـه و رسـيدن بـه سوسپانسيوني با تعداد اسپور مورد نظر محاسبه شد.
طرح مطالعه
جهت انجام آزمون Microdilution و آزمـون تعيـين خواص ضد قارچي قطعات پنيـر بـه روش ۶ ،Overlay نمونه پنير كه هر كدام حاوي يكي از باكتري هـاي مولـد اسيدلاكتيك مورد مطالعه بودند، در ظروف ۴۰۰ گرمـي توليد شد. همچنين يك نمونه پنير نيز با استارتر R-704 جهت مقايسه با باكتريهاي مـورد مطالعـه توليـد شـد.
جهت بررسي ميزان رشد مستقيم كپكها بر سطح پنيـر، ۶ نمونه پنير كه هر كـدام حـاوي يكـي از بـاكتري هـاي مولد اسيدلاكتيك مورد مطالعه بودند، درون پليـت هـاي استريل تهيه و همچنين يك نمونه نيز با استارتر R-704 جهت مقايسه با باكتري هاي مورد مطالعه توليد گرديد.
آزمون Microdilution
آزمون Microdilution عصاره پنير در اين آزمون فعاليت ضـد كپكـي عصـاره پنيـرهـاي توليد شده مورد بررسي قرار گرفت. بـراي ايـن كـار از پنيرها، عصاره بدون سلول تهيه شد. براي تهيـه عصـاره بدون سلول پنيرها، ۱۰گرم از پنيرهـاي توليـدي بـا ۱۰ ميلـيليتـر آب مقطـر اسـتريل همـوژن شـد و پـس از سـانتريفوژ كـردن، مـايع رويـي از فيلتـر غشـايي ۰/۲۲ ميكرون عبور داده شد. آزمون بـر روي ايـن مـايع و در پليت هاي ۹۶ خانه اي انجـام شـد. بـراي ايـن كـار ۱۵۰ميكروليتــر از محــيط كشــت Sabouraud Dextrose Broth به هـر چاهـك افـزوده شـد و ۱۵۰ميكروليتـر عصـاره بـدون ســلول بـه چاهــك اول افـزوده شــد و رقيق سازي سريالي در چاهك هاي بعدي انجـام گرفـت.
در نهايت ۱۰ميكروليتر از محلول اسپور كپك هاي مورد آزمـايش بـا تعـداد ۵ واحـد لگـاريتمي اسـپور در هـرميليليتر به تمام چاهك ها اضافه گرديـد. پـس از انجـام ايــن مراحــل، پليــت بــه دســتگاه ميكروپليــت ريــدر (مدل Micro 200Rساخت آمريكا) انتقال داده شد و در دمــاي ۳۰درجــه سلســيوس بــه مــدت ۴۸ســاعت گرمخانه گذاري انجام شد و هر نيم ساعت يك بـار OD چاهك ها در طـول مـوج ۵۵۰ نـانومتر توسـط دسـتگاه قراعت گرديد. نتايج اين آزمون به صورت نمـودار ODدر مقابل زمان به دست آمد.
تفسير نتايج
جهت تفسير نتايج از مساحت سطح زير منحني Area (AUC) under the curveاستفاده شد. برخي محققـين از مساحت سطح زير نمودار جهـت نشـان دادن ميـزان رشـد ميكروارگانيسـم اسـتفاده كردنـد و آن را بهتـرين پارامتر براي اين كار معرفي نمودند.
بــراي محاســبه (Gutierrez and Sandholm, 1989) سطح زير منحني از روش ذوزنقه اي استفاده شد.
در اين معادله i دفعات قرائت ODتوسط دسـتگاه، n تعداد كل دفعات قرائت دستگاه كه در اين آزمـايش ۹۷ مي باشد، m مقادير OD قرائت شده توسط دسـتگاه و t فواصل زماني بين قرائت هاي دستگاه است كـه در ايـن جا ۰/۵ميباشد.
آزمون تعيين خواص ضدقارچی قطعات پنيـر بـه روشOverlay
در اين آزمون از پنيرهاي توليدي قطعـات اسـتوانه اي شكل با ارتفاع ۲ تا ۳ميليمتـر تهيـه و در وسـط پليـت قرار داده شد. پس از آن محيط مـذاب MEA تـا سـطح پنيرها اضافه شد. پس از آن به محيط كشت فرصت داده شد تا منعقد گردد. سپس ۱۰ميليليتـر از محـيط MEA حاوي ۰/۷ درصد آگار بـه همـراه ۱ميلـيليتـر محلـول اسـپور كپـك مـورد نظـر بـا تعـداد ۴ لـوگ اسـپور در ميليليتر به سطح هر پليت اضافه شد. پليـت هـاي آمـاده شده به مدت ۴۸ساعت و در دماي ۳۰درجه سلسيوس گرمخانـــه گـــذاري شـــدند. پـــس از اتمـــام زمـــان گرمخانه گذاري از نمونه ها در شرايط يكسـان بـه لحـاظ نور و فاصله نمونه تا دوربين، عكس تهيه شـد. پـس از تهيه عكـس از نمونـه هـا، توسـط نـرم افـزار Rawak software مساحت هالـه بازدارنـدگي رشـد، مساحت قطعه پنير مورد آزمايش و مساحت كـل پليـت محاسبه شد.
به دليل تفاوت هاي جزئي كـه در مسـاحت قطعات پنير مورد آزمايش وجود داشت مسـاحت هالـه خالص بازدارندگي محاسبه شد كه از تفاضـل مسـاحت هاله بازدارندگي و مساحت قطعـه پنيـر مـورد آزمـايش محاسبه ميشود. براي محاسبه درصد بازدارندگي رشـد از معادله استفاده شد:
۱۰۰*مساحت کل پنیر/(مسـاحت هاله بازدارندگي-مساحت قطعـه پنيـر) = درصد بازدارندگي از رشد
آزمون بررسی ميزان رشد مستقيم كپك ها بر سطح پنير
در اين آزمون پس از توليد پنير، به سطح تمام نمونه ها ۱۰۰ميكروليتر محلول حاوي اسپور كپـكهـاي .A flavus و A. parasiticus با تعـداد ۴ لـوگ اسـپور در ميليليتر اضافه شد. سپس پنيرهاي توليد شـده در دمـا- هاي ۱۵ ،۴ و ۳۰ درجه سلسيوس نگهداري شده و زمان ظاهر شدن كپك روي نمونه ها مورد بررسي قرار گرفت.
آناليز آماری
براي انجام آناليز داده ها و بررسي اطلاعات به دسـت آمده از آزمون هاي مختلـف از طـرح بلـوك هـاي كامـل تصادفي استفاده شـد. بـه منظـور تعيـين اخـتلاف بـين ميانگين اعداد ( حداقل سه تكرار براي هر آزمايش)، پس از آناليز واريانس از آزمون چند دامن هاي دانكن در سطح ( P<0/05) استفاده گرديـد. در تمـام مراحـل، تجزيـه و تحليل آماري داده ها با اسـتفاده از نـرم افـزار SAS 9.1 صـورت گرفـت. تعيـين ضـرايب همبسـتگي بـا روش پيرسون و با استفاده از نرم افزار Minitab انجام گرفت.
آزمون Microdilution عصاره پنير
نتايج مساحت سطح زيـر منحنـي در ايـن آزمـون در مورد كپك A. flavus تعیین شد.به جز زمان صفر، در هـر كدام از زمان هاي آزمايش عصاره پنيرهاي توليد شده بـا داراي L. casei D31 و L. pentosus H39 بـاكتري هـاي كمترين ميزان مساحت سطح زير منحني هستند كه نشان دهنده اين اسـت كـه در بـين عصـاره پنيـرهـاي مـورد آزمايش، بيشترين اثر ضد قارچي را داشته انـد. همچنـين عصاره پنير توليـدي بـا بـاكتري L. plantarum KU13 داراي بيشـترين مسـاحت سـطح زيـر منحنـي اسـت وبنابراين داراي كمترين اثر ضد قارچي در بين باكتري هاي مورد آزمايش ميباشد.
در مورد اثر زمان بر نتايج ايـن آزمـون، غيـر از زمـان صفر، نتايج بقيه زمان ها تفاوت معني داري با هم ندارنـد و هر كدام ازعصاره هاي پنير نتايج نسـبتاً يكسـاني را در زمان هاي مختلف از خود نشان دادهانـد. در زمـان صـفر هيچ كدام از نمونه ها با هم تفاوت آماري نداشـته و هـر نمونه در زمان صفر نسبت به ساير زمان هـا، سـطح زيـرمنحني بيشـتري دارد. البتـه ايـن مـورد در عصـاره پنيـر توليدي با اسـتارتر پنيـر مشـاهده نمـي شـود و در تمـام زمان هاي آزمايش ميزان سطح زير منحني اين نمونه بالا است.
نتــايج ســطح زيــر منحنــي در مــورد كپــك .A parasiticus نشان داد به جز زمـان صـفر، عصـاره پنيـرهـاي توليــد شــده بــا بــاكتريهــاي L. NBRC107151پ plantarumو L. casei D31 داراي كمتــرين ميــزان مساحت سطح زير منحني هستند كـه نشـان دهنـده ايـن است كه در بين عصاره پنيرهاي مورد آزمايش، بيشترين اثر ضد قارچي را داشته اند. همچنين عصاره پنير توليـدي بــا بــاكتري L. plantarum KU13 داراي بيشــترين مســاحت ســطح زيــر منحنــي اســت و بنــابراين داراي كمترين اثر ضدقارچي در بين باكتريهاي مورد آزمايش ميباشد.
نتـايج ايـن آزمـون
در اين آزمون نيز مانند آزمون مشابه بر روي كپك .A flavus در مورد اثر زمان بر نتـايج ايـن آزمـون، غيـر از زمان صفر، نتايج زمـان هـاي مختلـف آزمـايش تفـاوت معني داري با هم ندارند و عصاره پنيرهاي مورد آزمايش نتايج نسبتاً يكساني در زمان هاي مختلف از خـود نشـان دادند. اين آزمون در مورد ارزيابي اثر ضدميكروبي موادمختلف مانند اسانس هاي گياهي كاربرد داشـته اسـت و در اين تحقيق براي اولين بـار در مـورد نشـان دادن اثـر ضدقارچي باكتريهاي مولد اسيدلاكتيك در محيط پنيـر استفاده شد.
تعيين خواص ضد قارچي قطعات پنير به روش Overlay نتايج درصد بازدارندگي بر عليه رشد كپك هاي مـورد آزمايش در جداول ۳و ۴ آمده اسـت. همـانگونـه كـه مشاهده ميشود، غير از پنير توليدي با بـاكتري L. casei ،D31 بين تمامي نمونه هاي توليدي پنير با باكتري هـاي مولد اسيد لاكتيك و نمونه ي توليدي با استارتر پنيـر بـه لحاظ آماري تفاوت معني داري وجـود داشـت.
بيشترين و کمترین درصد بازدارنـدگی
در بـين پنيرهاي توليدي بـا بـاكتري هـاي مولـد اسـيد لاكتيـك، پنيرهاي توليد شده با دو باكتري L. plantarum PINو L. plantarum CAG23 بيشترين درصد بازدارنـدگي را بر عليه رشد هر دو كپك داشتند و پنيـر توليـد شـده بـا باكتري L. casei D31 كمتـرين درصـد بازدارنـدگي را نشان داد، به طوري كه درصـد بازدارنـدگي آن بـا پنيـر توليدي از استارتر پنير تفاوت معني داري را نشـان نـداد.
رشد مستقيم كپك بر سطح پنير نتايج اين آزمون بـه صـورت تعـداد روز لازم جهـت رشد كپك در جداول ۵و ۶ آمده است. همانگونـه كـه مشاهده ميشود در تمام دماهاي آزمايش و در مورد هر دو كپك، همه نمونه ها بـه جـز نمونـه پنيـر توليـدي بـا باكتري L. plantarum KU13 توانستند نسبت به نمونه توليدي با استارتر پنير، ايجاد كپك را در سطح پنيـر بـه تعويق بياندازند.
باكتري هـاي L. plantarum PINو .L plantarum CAG23 بيشترين بازدارنـدگي را بـر عليـه رشـــد كپـــك هـــا بـــر ســـطح پنيـــر داشـــتند. نتايج همبستگي داده هاي حاصل از آزمون هاي مختلف همانگونه كه در جداول ۷و ۸ ملاحظه ميشـود، در مورد هر دو كپك مـورد آزمـايش، بـين نتـايج آزمـون overlay قطعات پنير و رشد مستقيم كپك بر سطح پنير همبستگي مثبـت و معنـي داري وجـود دارد و ايـن دو آزمون با آزمون Microdilution همبستگي معنـي داري ندارند.
بحث و نتيجه گيری
همانگونه كه از نتايج مشـخص اسـت، بـاكتريهـاي مورد آزمايش توانستند به صورت معني داري در مقايسه با استارتر صنعتي توليد پنير، رشد كپك ها را بـه تعويـق بياندازد. ايـن مـورد نشـان از توانـايي قابـل قبـول ايـن باكتري ها در كنترل رشد كپك است و ميتـوان از آنهـا به عنوان نگهدارنده هاي بيولوژيكي در پنير استفاده كـرد كه اين مورد به لحاظ اقتصادي و بهداشتي حائز اهميـت است.
تحقیقات محيالدين
در سال ،۲۰۱۱ محيالدين و همكاران اثر مهاركنندگي L. pentosus ، L. fermentum Te007 بـاكتريهـاي P. pentosaceus Te010 وL. paracasei D5 ، G004 را برعليـه كپـك هـاي A. nigerو A. oryzae در پنيـر فرآوري شده نشان دادند.
پنيرهـاي بـدون بـاكتريهـاي مورد آزمـايش مانـدگاري ۴تـا ۶روز را در ۳۰درجـه سلسـيوس نشـان دادنـد و نمونـه هـاي توليـدي توسـط باكتري هاي مورد آزمايش از ۶تا ۹روز رشـد كپـك را به تـأخير انداختنـد. در حـالي كـه بـاكتري هـاي مـورد آزمايش در اين تحقيق نتايج بسيار بهتري را نسـبت بـه تحقيق فوق نشان دادند زيرا باكتريهـاي مـوثر در ايـن آزمـون توانسـتند رشـد A. flavus را ۱۰ تـا ۱۱روز و كپــك A. parasiticusرا ۱۵ تــا ۱۷ روز بــه تــأخير انداختند. لازم به توضـيح اسـت كـه در هـر دو تحقيـق نمونه هـاي توليـدي بـدون حضـور بـاكتريهـاي داراي خواص ضدقارچي نتايج مشابهي را از خود نشان دادند.
مقایسه آزمون Overlay و آزمون Microdilution
آزمـون Overlay قطعـات پنيـر توانسـت بـه خـوبي تفاوت بين نمونه هاي توليـدي را در مهـار رشـد كپـك نشان دهد. اين آزمون در تحقيقي بـراي نشـان دادن اثـر بـرEnterococcus faecium FAIR-E 198 كشـندگي عليه ليستريا در پنير اسـتفاده شـده اسـت .
آزمون Microdilution نيز هماننـد دو آزمـون ديگـر تفاوت بين پنيرهاي توليدي از باكتريهاي مورد آزمايش و استارتر صنعتي را نشان داد. اين مورد نشان مـيدهـد كــه از ايــن آزمــون مــيتــوان جهــت نشــان دادن اثــر ضد قارچي باكتريهـاي داراي خاصـيت ضـدقارچي در پنير استفاده نمود.
در ايـن آزمـونهـا، نتـايج دو آزمـون Overlay قطعات پنير و رشد مستقيم كپك بر سطح پنير همبستگي مثبت و معني داري با هـم دارنـد. ايـن مـورد نشان دهنده يكسان بودن عامل محافظت كنندگي از رشد در اين دو آزمون ميباشد كـه شـامل بـر هـم كنشـي از حضور باكتري و مواد ضد قارچي توليد شده از بـاكتري است.
نتايج آزمون Microdilution بـا دو آزمـون ديگـر همبستگي معني داري ندارنـد. چـرا كـه در هـر كـدام از آزمون هاي انجام شده، عاملي كه موجـب جلـوگيري از رشــد كپــك مــيشــود متفــاوت اســت. در آزمــون Microdilution از عصاره بدون سلول پنيرهاي توليـدي استفاده شد و بنابراين عامل ضد كپكي در اين آزمون تنها مواد ضد قارچي توليدي در پنيرها اسـت و خـود سـلول باكتري مولد اسيدلاكتيك در اين آزمون نقشي ندارد. در دو آزمون ديگر به دليل استفاده از خود پنير، هم سـلول باكتري و هم مواد ضـدقارچي در آزمـون نقـش دارنـد.
بنابراين ميتوان گفت تفاوت نتايج اين آزمونها به ايـن دليل مي باشد. از اين مورد ميتوان نتيجه گرفـت كـه بـا آزمون Microdilution عصاره هاي پنير ميتوان توانـايي باكتريهاي مورد آزمايش را در توليد مـواد ضـد قارچي در محيط پنير بررسي كرد و از دو آزمون ديگر ميتـوان Archive of SID توانايي كلي اين باكتري ها را در به تعويق انداختن رشـد كپك در پنير مورد بررسي قرار داد.
به عنوان مثال بـاكتري L. casei D31در آزمـونهـاي overlay قطعات پنير و ميزان كپك زدگـي سـطح پنيـر عملكرد خوبي در مهار رشد كپك نشان نداد و حتـي در آزمون overlay قطعات پنير تفاوت معنـي داري بـا پنيـر توليــدي بــا اســتارتر پنيــر نداشــد، امــا در آزمــون Microdilution داراي كمتــرين مســاحت ســطح زيــر منحني بوده و بهتـرين اثـر ضـدكپكي را نشـان داد. كـه ميتوان نتيجه گرفت اين باكتري ميتواند مواد ضد كپكي قابل توجهي توليد نمايد اما خود سلول اثر آنتاگونسـتي زيادي بر رشد كپك ندارد.
البته به دليـل نزديـك بـودن شــرايط دو آزمــون Overlay قطعــات پنيــر و ميــزان كپك زدگي سطح پنير به شرايط كلي حاكم بر رشد كپك بر روي پنير حين نگهداري، از نتايج اين دو آزمون مـي- توان جهت ارزيابي توانايي واقعي اين باكتريها بر عليـه رشد كپك در پنير استفاده نمود و نتايج ايـن دو آزمـون بهتر ميتواند توانايي باكتريهـاي مـورد آزمـايش را درپنير نشان دهد.
آزمون Microdilution و در كل سنجش ميزان OD و ارتباط دادن آن به ميزان رشد ميكروارگانيسم ها، تـاكنون در پژوهش هاي مرتبط با باكتري ها انجام شـده اسـت و در مورد كپك ها به دليل پيچيدگي هاي رشد آنها، توليد ميسليوم از اسپورها و همچنـين امكـان توليـد ميسـليوم بدون ايجاد كدورت، استفاده از اين آزمـون را بـا ابهـام مواجه ميكند. اگرچه آزمـون Microdilution توانسـت تفاوت بين نمونه هـاي توليـدي بـا بـاكتري هـاي مـورد آزمايش و استارتر صنعتي را نشان دهد اما بـا توجـه بـه موارد ذكـر شـده ايـن آزمـون جهـت بررسـي خـواص ضــد كپكي بــاكتري هــاي مولــد اســيدلاكتيك صــحيح نمي باشد.
نتیجه گیری
در كل با توجه به نتايج به دست آمده ميتـوان گفـت براي بررسي اثرات ضدقارچي باكتري هـاي مختلـف در محيط پنير ميتوان از آزمون هاي پيشـنهاد شـده در ايـن تحقيق استفاده نمود. جهت بررسـي اثـرات ضـدقارچي مناسب ترين راه رشد مسـتقيم كپـك بـر روي محصـول غذايي و مقايسه نمونه هاي توليدي با باكتري هاي مـورد آزمايش و نمونه كنترل و بدون اثر ضد قارچي ميباشـد.
در ايـن تحقيــق نشـان داده شــد كـه آزمــون Overlay قطعات پنير همبستگي معني داري با نتايج رشد مسـتقيم كپك بر روي پنير دارد بنابراين ميتوان گفـت كـه ايـن آزمون نيز ميتواند به خوبي اثر ضد قارچي باكتري هـاي مـورد آزمـايش را در پنيـر نشـان دهـد. نتـايج آزمـون Microdilution عصــاره هــاي پنيــر اگرچــه همبســتگي معني داري با دو آزمون ديگر نشان ندادند، امـا توانسـت بين نمونه هاي توليدي با باكتريهـاي مـورد آزمـايش و استارتر صنعتي تفاوت معنيداري نشان دهد. علـيرغـم اين موضوع به دليل اينكـه نمـيتـوان OD را سنجشـي براي رشد كپك دانست، استفاده از ايـن آزمـون در ايـن مورد توصيه نمي شود.
این پژوهش توسط محققان گروه علوم و صنايع غذايي، دانشكده كشاورزي، دانشگاه شيراز، انجام گرفته است. با تشکر از زحمات این عزیزان.
