باكتري هاي اسيد لاكتيك پنير سنتي ليقوان

۴ اردیبهشت, ۱۴۰۱

باكتري هاي اسيد لاكتيك پنير سنتي ليقوان

جداسازي و شناسايي باكتري هاي اسيد لاكتيك پنير سنتي ليقوان

مقدمه

پنير ليقوان پنيري نرم (داراي حدود  ۶۰درصد رطوبت) مي باشد كه با استفاده از شير خام گوسفند و بز در دهكده ليقوان از توابع تبريز به روش سنتي تهيه مي شود و به لحاظ خوش طعم بودن از مقبوليت زيادي برخوردار است. در توليد پنير ليقوان استارتر به آن اضافه نمي شود و تخمير به فلور لاكتيكي شير خام مصرفي وابسته است.

پنیر لیقوان

خصوصيات كيفي و حسي پنير نظير بافت، بو، طعم و… به عوامل مهمي از جمله به نوع شير مصرفي، كيفيت ميكروبي آن، تكنولوژي به كار رفته در ساخت پنير و شرايط رسيدن آن بستگي دارد، اگرچه باكتري هاي اسيد لاكتيك در توليد تركيبات طعم دار و توسعه طعم نقش اساسي دارند، زيرا اين باكتريها قادر به تبديل اجزاي شير به تركيبات فراري هستند كه نقش مهمي در گسترش طعم پنير ايفا ميكنند. باكتري هاي اسيد لاكتيك به طور گسترده در طبيعت پراكنده هستند، آنها فلور ميكروبي غالب در شير و فرآورده هاي لبني مي باشند تعدادي از گونه ها در توليد صنعتي محصولات لبني دخالت دارند در اين گروه از باكتري ها، جنس هايي نظير لاكتوباسيلوس، لاكتوكوكوس  ، پديوكوكوس و لوكونستوك  قرار دارند.

پنير ليقوان

پنير ليقوان يكي از مهمترين و رايج ترين محصولات لبني در ايران است كه در همه نقاط كشور استفاده از آن پذيرفته شده و مورد توجه است و از شير غيرپاستوريزه تهيه مي شود. پنير تهيه شده از شير پاستوريزه داراي كيفيت بهداشتي بهتر و بافت يكنواخت تر است اما پاستوريزاسيون اثرات مخرب بر طعم دارد چرا كه تعدادي از ميكروب هايي كه مسئول توسعه طعم پنير هستند به وسيله پاستوريزاسيون حذف خواهند شد.

راه حل اين مشكل در توليد فرآورده با استفاده از شير پاستوريزه،استفاده از استارتر بومي آن بعد از فرآيند پاستوريزاسيون مي باشد. بنابراين با توجه به اهميت باكتري هاي اسيد لاكتيك به عنوان يكي از پارامترهاي اصلي تشكيل خواص حسي (نظير طعم و بافت و… ) در پنير ليقوان، هـدف از انجام ايـن پژوهش شناسايي گونه هاي مختلف باكتري هاي اسيد لاكتيك موجود در پنير ليقوان بود كه اولين مرحله براي توسعه يك استارتر خالص از گونه هاي شناسايي شده به منظور توليد پنير ليقوان سالم و بافت يكنواخت با استفاده از شير پاستوريزه در سطح صنعتي است.

مواد و روشها

نمونه گيري:

در فصل پائيز،  ۴نمونه پنيـر  ۱كيلـوگرمي از پنير سنتي ليقوان با دوره رسيدگي  ۴ماهه از چهار توليدي واقع در دهكده ليقـوان تبريـز تهيـه گرديـد، نمونـه هـا در شــرايط دمــايي  ۴درجــه ســانتيگــراد بــه آزمايــشگاه ميكروبيولوژي دانشكده كشاورزي دانشگاه گرگـان منتقـل شدند.

آماده سازي نمونه هاي پنير:

۲۵ گرم پنير به  ۲۲۵ ميليليتر محلول استريل سيترات سديم  ۲درصد وزني- حجمي اضافه و در دستگاه استومكر (مدل سيوارد ،۵آلمان) براي يك دقيقه با دور نرمال مخلوط گرديد، سپس محلول رويي به عنوان رقت  ۱۰-۱براي تهيه رقت هاي بعدي مورد استفاده قرار گرفت، رقت هاي  ۱۰-۲ تا  ۱۰-۵در آب پپتونه استريل  ۰/۱درصد وزني- حجمي تهيه شد.

۰/۱ميليليتر از رقت هاي  ۱۰-۴و  ۱۰-۵تهيه شده به وسيله سمپلر بر سطح محيط جامد  ۶MRS و  M17 تزريق و به صورت سطحي كشت داده شد. پليت ها در دماي ۳۰و  ۳۷ درجه سانتيگراد به منظور ايجاد رشد بهينه براي باكتري هاي مزوفيل و دماي  ۴۲ درجه سانتيگراد به منظور رشد بهينه باكتري هاي گرمادوست در شرايط بي هوازي با استفاده از جار بي هوازي و گازپك (نوع  ،Aآلمان) گرمخانه گذاري شدند.

كشت ها در دو تكرار انجام شدند (لاسردا و همكاران، ۲۰۰۵؛ تورزلانز و همكاران،  ۲۰۰۶) از كلني هاي رشد يافته با اشكال مختلف بر محيط هاي كشت ياد شده،  ۳ كلني به صورت تصادفي برداشته و پس از ۲-۳ بار پاساژ بر محيط هاي كشت قبلي خالص سازي شدند و از نظر كاتالاز، گرم و مورفولوژي سلولي آزمايش گرديدند از  ۴۸۰ كلني خالص شده،  ۵۴ ايزوله براساس فراواني مورفولوژيكي جهت شناسايي انتخاب شدند.

براي نگهداري كوتاه مدت، كشت ذخيره ايزوله ها بر محيط كشت  MRS جامد كه به صورت شيبدار (آگار مورب) مي باشد منتقل و هر ماه يك بار كشت مجدد انجام شد براي نگهداري طولاني مدت، ايزوله هاي باكتريايي در محيط  MRS مايع تلقيح و سپس لوله ها به منظور جدا كردن سلول هاي باكتريايي سانتريفوژ شدند. سوپرناتانت حذف و رسوب حاصل به نسبت( ۷۰به  ۷۰۰ ۳۰ميكروليتر) از محيط كشت فوق به همراه  ۳۰۰ ميكروليتر گليسرول استريل  ۵۰درصد به لوله هاي اپندورف منتقل شد و بلافاصله در ازت مايع منجمد گرديد، لوله اي ياد شده در فريزر  -۸۰درجه سانتيگراد به صورت منجمد نگهداري شدند.

آزمون هاي بيوشيميايي:

براي همه ايزوله ها تست كاتالاز و گرم انجام شد، خصوصيات مورفولوژي سلولي و توليد گاز از گلوكز با لوله دورهام بررسي شد و سپس ايزوله ها در گروه هاي فنوتيپي جداسازي شدند. كوكسي هاي گرم مثبت، كاتالاز منفي همـوفرمنتاتيو قادر به رشد در دماي  ۱۰و  ۴۵ درجه سانتيگراد به عنوان انتروكوكوس در نظر گرفته شدند و آزمون هاي شرمن شامل:

توانايي رشد در  ،pH=9/6رشد در بايل ۴۰ ۲درصد، رشد در  ۶/۵درصد نمك كلرور سديم و بقا بعد از حرارت دادن در دماي ۶۰ درجه سانتيگراد به مدت  ۳۰دقيقه براي تأييد بيشتر انجام شد.

اسنيث و كوكسي هاي گرم مثبت و كاتالاز منفي هموفرمنتاتيو با آرايش سلولي تتراد به عنوان پديوكوكوس در نظر گرفته شدند. كوكسي هاي گرم مثبت و كاتالاز منفي هتروفرمنتاتيو به عنوان لوكونوستوك و كوكسي هاي گرم مثبت و كاتالاز منفي هموفرمنتاتيو قادر به رشد در دماي  ۱۰درجه سانتيگراد و عدم رشد در  ۴۵درجه سانتي گراد به عنوان لاكتوكوكوس شناسايي شدند. براي باسيل هاي گرم مثبت و كاتالاز منفي، رشد در دماي  ۱۵و  ۴۵ درجه سانتي گراد، توليد گاز از گلوكز انجام شد.

به منظور شناسايي ايزوله ها در سطح گونه تخمير كربوهيدرات ها شامل گلوگز، لاكتوز، ساكاروز، گالاكتوز، فروكتوز، ملي زيتوز، رافينوز، گزيلوز، آرابينوز، گلوكونات، سوربيتول، ريبوز، مانوز، مانيتول در محيط پايه با فرمول زير پيگيري شد (۰/۸درصد عصاره مخمر،  ۰/۸ درصد تريپتون،  ۱/۲درصد پپتون،  ۰/۱درصد توئين و ۰/۰۰۴ درصد برموفنل بلو به عنوان معرف و  ۲ درصد غلظت نهايي قند مورد نظر) انجام شد.

توليد گاز دي اكسيدكربن از گلوكز در لوله آزمايش حاوي محيط كشت مايع فوق و لوله دورهام وارونه مورد بررسي قرار گرفت. براي تأمين شرايط بي هوازي  ۱ميليليتر پارافين مايع استريل بر سطح محيط قندي اضافه گرديد. همه آزمايش ها در دو تكرار انجام گرفت. نتايج آزمايش هاي بيوشيميايي ايزوله هاي شناسايي شده با خصوصيات بيوشيميايي باكتري هاي اسيد لاكتيك در كتاب برگيس و كتاب جنس هاي باكتري هاي اسيد لاكتيك مطابقت داده شد و ايزوله ها در سطح جنس و گونه شناسايي شدند.

نتايج و بحث

همه ايزوله هاي شناسايي شده گرم مثبت، كاتالاز منفي و بدون اسپور بودند. براساس خصوصيات مورفولوژيكي و بيوشيميايي، ۶جنس از گروه باكتريهاي اسيد لاكتيك شامل جنس هاي لاكتوباسيلوس، استرپتوكوكوس، انتروكوكوس، لاكتوكوكوس، لوكونوستوك و پديوكوكوس در سطح گونه شناسايي شدند و  ۷ايزوله قابل شناسايي نبودند.

توزيع جنس هاي شناسايي شده باكتريهاي اسيد لاكتيك:

ايزوله هاي شناسايي شده متعلق به جنس هاي لاكتوباسيلوس، انتروكوكوس، استرپتوكوكوس، پديوكوكوس، لوكونوستوك و لاكتوكوكوس به ترتيب ( ۳۰) ۵۵/۵ايزوله، (۶) ۱۱/۱۱ ايزوله،  (۵) ۹/۲۵ايزوله ،  (۳) ۵/۵۵ايزوله ، (۲) ۳/۷۰ ايزوله و  (۱) ۱/۸۵ايزوله درصد از كل ايزوله ها را تشكيل مي دادند.

از ايزوله هاي شناسايي شده در اين تحقيق،  ۴۶ايزوله ( ۸۵درصد) از دماي ۳۰ و  ۳۷ درجه سانتيگراد و  ۸ ايزوله ( ۱۵درصد) از دماي  ۴۲ درجه سانتي گراد ايزوله شدند كه اين نشان مي داد كه غالب باكتري هاي اسيد لاكتيك پنير ليقوان گونه هاي مزوفيل هستند.

جنس هاي لاكتوباسيلوس، انتروكوس و پديوكوكوس فلور لاكتيكي شناسايي شده توسط عبدي و همكاران در پنير ليقوان بودند كه لاكتوباسيلوس هاي مزوفيل، انتروكوكوس و پديوكوكوس به ترتيب  ۴۲ ،۴۶و  ۱۲درصد كل ايزوله ها را تشكيل ميدادند. او همچنين فلور غالب لاكتيكي پنير ليقوان را گونه هاي مزوفيل معرفي كرد.

باكتريهاي اسيد لاكتيك ميل هاي مزوفيل هموفرمنتاتيو ( ۹۴/۴درصد) و هتروفرمنتاتيو ( ۵/۵درصد) را به عنوان فلور غالب لاكتيكي در طول رسيدن سوسيس سارديني معرفي نمودند (گريكو و همكاران،  ۲۰۰۵) نتايج اين تحقيق نيز با نتايج عبدي در پنير ليقوان مشابهت داشت.

تعداد  ۳۰ ايزوله به عنوان گونه هاي لاكتوباسيلوس شناسايي شدند كه بيشترين در صد فراواني ( ۵۵/۵درصد) را در بين جنس هاي شناسايي شده به خود اختصاص مي دادند غالب بودن لاكتوباسيلوسها نيز در فرآورده هاي مختلف گزارش شده است.

همه ايزوله هاي شناسايي شده به جز  L. Salvariusكه در گروه همـوفـرمنتاتيـو اجباري قرار دارد، بقيه در گروه هتـروفـرمنـتـاتيـو اختـياري طـبـقـه بنـدي شـده انـد. در ايـن جـنـس گـونـه هـاي ،L. Plantarum ،L. Agilis L. Paracasie ،L. Intestinalis ،L.   AcetotoleranceشناساييL. Maltaromicus   وSubsp Paracasie شدند كه به ترتيب  ۲ ،۱ ،۱ ،۱ ،۸ ،۱۳و  ۴ايزوله از كل ايزوله هاي شناسايي شده جنس لاكتوباسيلوس را تشكيل مي دادند.

لاكتوباسيلوس پاراكازئي زيرگونه پاراكازئي در محصولات لبني مصري شناسايي شده كه قدرت اسيدي كنندگي ضعيف و همچنين داراي فعاليت آنتي ميكروبي بوده است.

لاكتوباسيلوس ها به عنوان گونه هاي غالب در پنيرهاي تهيه با شيرخام گزارش شده اند، زيرا اين ارگانيسم ها قادرند كه تحت شرايط انتخابي شديد نيز به رشد ادامه دهند و به دليل ويژگي هاي پروتئوليتيك عالي، نقش اساسي در ايجاد خصوصيات حسي محصول از خود نشان دهند.

۲ايزوله به عنوان استرپتوكوكوس ترموفيلوس ،۱ايزوله استرپتوكوكوس دونئي  ۲و  ۲ايزوله استرپتوكوكوس اوراليس  ۳شناسايي شدند. حضور  ۳نژاد شناسايي شده استرپتوكوكوس دونئي و استرپتوكوكوس اوراليس از پنير ليقوان ممكن است دليلي بر شرايط غيربهداشتي مرحله شيردوشي باشد. استرپتوكوكوس يوبريس ۴از پنير فرسكو مكزيكي شناسايي شده كه به گروه استرپتوكوكوس هاي ديگر تعلق دارد كه حضور آن همراه استرپتوكوكوس اويوم  به شرايط شيردوشي غيربهداشتي ارتباط داده شده است.

استرپتوكوكوس ترموفيلوس از شير بز الجزايري و قبلاً محصولات لبني مصري ايزوله شده است.

يك ايزوله به عنوان لاكتوكوس لاكتيس زيرگونه لاكتيس ۶يا لاكتوكوكوس گارويه  ۷شناسايي شد كه آزمايش هاي بيوشيميايي قادر به تفكيك دو گونه از هم نبودند. ايزوله ياد شده از محيط  M17 و دماي  ۳۰ درجه سانتي گراد ايزوله گرديد. لاكتوكوكوس لاكتيس زيرگونه لاكتيس و لاكتوكوكوس لاكتيس زيرگونه گارويه در محصولات لبني مختلف شناسايي شده اند.

بررسي فلور لاكتيكي پنيرهاي مختلف نظير پنير تولوم نشان داده كه گونه هاي استرپتوكوكاسه در ابتداي دوره رسيدن غالب هستند بيشتر لاكتوكوكوسها در طول رسيدن و بعد از نمك زدن پنيرها خواهند مرد و به تدريج جاي خود را به لاكتوباسيلوسها كه مقاوم به شرايط اسيدي هستند، ميدهند.

اولين عملكرد لاكتوكوكسيها ابتدا تبديل لاكتوز به اسيد لاكتيك است و در مرحله بعد تشكيل دياستيل و ديگر تركيبات رايحه دار و طعم دار مي باشد. از طرفي اگرچه لاكتوكوكوسها اسيدي كننده هاي ضعيف هستند اما به دليل توانايي اسيدي كنندگي سريع مسئول اسيدي كنندگي ابتدايي مي باشند كه تشكيل دلمه و خروج آب پنير را تعيين نموده و از رشد باكتري هاي نامطلوب جلوگيري مي كنند.

از ايزوله هاي شناسايي شده، دو ايزوله كروي شكل با تخمير هتروفرمنتاتيو (توليد گاز از گلوكز) و الگوي تخمير كربوهيدراتها به عنوان لوكونوستوك مزنتروئيدس زيرگونه دكسترانيكم  و لوكونوستوك مزنتروئيدس زيرگونه مزنتروئيدس  شناسايي شدند. هر چند گونه هاي لوكونوستوك داراي قدرت اسيدي كنندگي و پروتئوليتيك ضعيف هستند اما به دليل توليد تركيبات معطر شاخص مثل اتانل، استوئين و دياستيل داراي اهميت مي باشند. از اين رو بر اين اساس يكي از دلايل عطر و طعم موجود در پنير ليقوان را مي توان به اين جنس نسبت داد.

از انتروكوكسي هاي شناسايي شده،  ۱ايزوله به گونه انتروكوكوس فكاليس  و  ۵ ايزوله به گروه فاسيوم تعلق  داشتند كه شامل  ۲نژاد انتروكوكوس دورانس ۲ ،نژاد انتروكوكوس هايره و  ۱نژاد انتروكوكوس فاسيوم بودند.

انتروكوكوسها بعد از لاكتوباسيلوسها بيشترين فلور لاكتيكي پنير ليقوان را به خود اختصاص دادند. حضور انتروكوكوس فاسيوم، انتروكوكوس فكاليس  ۱و انتروكوكوس دورانس  ۲در شير خام و پنير تهيه شده از شير خام معمول است.

انتروكوكوس فاسيوم و انتروكوكوس دورانس از پنير فرسكوي مكزيكي و پنير مصري و پنير ليقوان شناسايي شدهاند كه انتروكوكوس فاسيوم، گونه غالب در ميان ايزولههاي انتروكوكوس در پنيرهاي ياد شده گزارش شده است.

اين نتايج، با نتايج اين تحقيق مشابهت داشت.

انتروكوكوسها از فعاليت پروتئوليتيك بالايي بهخصوص بر كازئين و ديگر پروتئينهاي شير، همچنين فعاليت ليپوليتيك قوي برخوردارند به همين دليل انتروكوكوس ها مي توانند نقش مهمي در توسعه طعم پنير ليقوان داشته باشد.

تعدادي از نژادهاي انتروكوكوس بهعنوان استارتر به صورت تجاري استفاده مي شوند براي مثال استفاده از انتروكوكوس فاسيوم ( (K77D به عنوان يك استارتر در دانمارك مورد تأييد قرار گرفته است.

يك ايزوله به عنوان پديوكوكوس پنتاساكئوس زيرگونه اينترمديوس  و دو ايزوله به عنوان پديوكوكوس اينوپيناتوس  شناسايي شدند. دو ايزوله پديوكوكوس اينوپيناتوس داراي الگوي تخمير فروكتوز متفاوتي مي باشند. هر ۳ ايزوله از محيط  MRS آگار ايزوله شدند. پديوكوكوس پنتاساكئوس، پديوكوكوس دامنوس ، و پديوكوكوس پاروالوس  از گونه هاي شناسايي شده درمحصولات لبني مي پديوكوكوس ها در استارترهاي لبني استفاده نمي شوند اگرچه آنها مي توانند در پنير با دوره رسيدگي رشد كرده و باقيمانده لاكتوز را براي دوره طولاني تخمير كنند.

نتيجه گيري كلي

نتايج اين تحقيق نشان ميدهد كه يك كشت مخلوط استارتري براي توليد پنير ليقوان به روش صنعتي بايد شامل گونه هاي لاكتوباسيلوس آگيليس، لاكتوباسيلوس پلانتارم، گروه انتروكوكوس فاسيوم و گونه هايي از لاكتوكوكوس و لوكونوستوك به نسبت هاي مشخصي باشد. تحقيقات بيشتر براي يافتن سويه هاي تشكيل دهنده به طور دقيق تر و دستيابي به نسبت آنها لازم است.

این پژوهش توسط محققان گروه علوم و صنايع غذايي، دانشگاه علوم كشاورزي و منابع طبيعي گرگان و گروه علوم و صنايع غذايي، دانشگاه اروميه انجام گرفته است. با تشکر از این عزیزان.

اشتراک در تلگرام
,
Cresta Help Chat
Send via WhatsApp