پنیر فراپالایشی و نقش بازدارندگی کشت آغازگر لاکتیکی

  1. خانه
  2. /
  3. مقالات
  4. /
  5. پنیر فراپالایشی و نقش بازدارندگی کشت آغازگر لاکتیکی

رفتار سویه هاي مختلف یرسینیا انتروکولیتیکا در پنیر فراپالایشی و نقش بازدارندگی کشت آغازگر لاکتیکی

هدف از این تحقیق

هدف از این تحقیق مطالعه رفتار سویه هاي مختلف یرسینیا انتروکولیتیکا در پنیر فراپالایشی و بررسـی قابلیـت بازدارنـدگی کشـت آغازگر لاکتیکی بر این باکتري بود.

براي این منظور، شیر پاستوریزه و فراپالایش شده بـا تعـداد  ۳واحـد لگـاریتمی در هـر گـرم ازسویه هاي استاندارد  DSM 11502و  DSM 9499 و سویه بومی یرسینیا انتروکولیتیکا تلقیح شد و نمونه هـاي پنیـر دارا و فاقـد کشـت آغازگر تهیه شدند. تعداد یرسینیا انتروکولیتیکا در زمان تلقیح، متعاقب گرمخانه گذاري و طی  ۲ماه دوره نگهداري بـا روش کشـت در محیط   CINآگار شمارش و با آزمون   PCRمورد تأیید قرار گرفـت.

نتـایج مطالعـه

طبـق نتـایج مطالعـه، بعـد از گرمخانـه گـذاري تعـداد یرسـینیا انتروکولیتیکا در هر دو گروه از نمونههاي دارا و فاقد آغازگر به مقدار  ۴/۱۴واحد لگاریتمی افزایش پیدا کـرد. امـا طـی دوره نگهداري، تعداد این باکتري فقط در نمونه هاي حاوي آغازگر کاهش یافت. از آنجایی که مقدار  pH بین نمونه هـاي دارا و فاقـد آغازگر تفاوت معنی داري داشت؛ لذا شرایط اسیدي از عوامل اصلی مهار کننده یرسینیا انتروکولیتیکا در پنیـر فراپالایشـی می باشد.

بر اساس نتایج به دست آمده، سویه بومی یرسینیا انتروکولیتیکا در مقایسه بـا سـویه هـاي آزمایشـگاهی بـه طـور معنـی داري پایداري بیشتري در پنیر فراپالایشی داشت. با در نظر گرفتن نقش کشت آغازگر در غیرفعال نمودن یرسـینیا انتروکولیتیکـا، ایجاد شرایط دمایی و زمانی براي تکثیر و فعالیت مناسب باکتري هاي آغازگر و یا استفاده از کشتهایی بـا قابلیـت تولیـد ترکیبـات آنتاگونیستی میتواند علاوه بر ایجاد طعم و بافت مناسب در محصول، در کنترل مخاطره ناشی از آلودگی هاي احتمالی پنیر فراپالایشی موثر باشد.

مقدمه

یرسینیا انتروکولیتیکا از باکتري هاي مهـم بیمـاري زاي غذایی بوده و از نظر خصوصـیات مرفولـوژیکی شـامل باسیلها کوتاه، گرم منفی، غیر اسپورزا، اکسیداز منفـی و بی هوازي اختیاري است. ایـن بـاکتري قـادر بـه تحمـل تغییرات pHبین ۴تا ۱۰)مقدار مطلـوب  (۷/۶و مقـدار ۵ درصـد نمـک مـی باشـد .

محـدوده دمـاي مطلـوب رشد باکتري

رشد باکتري در دامنه دمایی ۰تا ۴۵ درجـه سلسیوس و محـدوده دمـاي مطلـوب ۲۵تـا ۲۹ درجـه سلسـیوس صـورت مـیگیـرد. به دلیل دارا بودن طبیعت سرماگرا، ایـن بـاکتري میتواند بدون ایجاد علایم ظاهري فساد، در مواد غذایی نگهداري شده در یخچال رشد و تکثیر نموده و موجـب عــوارض گونــاگونی شــود.

یرسینیا انتروکولیتیکا

یرسینیا انتروکولیتیکا عامـل بیمـاري یرسینیوزیس در انسان است و علایم عفونـت از اسـهال ملایم و محدود شونده تا لنفادنیت مزانتریک متغیر اسـت. از دیگــر عــوارض و ســندرم هــاي بــالینی ناشــی از آن مــیتــوان بــه ســپتیســمی، آپاندیســیت کــاذب، فارنژیتاکسوداتیو و آرتریـت اشـاره نمـود.
یرســینیا انتروکولیتیکــا اغلــب در خــاك، فاضــلاب، آب هاي شیرین و همچنین در مواد غذایی نظیر گوشـت قرمز، گوشت ماکیان، شیر و فرآورده هاي آن، تخـم مـرغ، سبزیجات و … یافت میشود.

بین سویه هاي مختلف این باکتري فقط تعداد محـدودي بیماری یزاي انسـانی هسـتند و در میـان منـابع مختلـف غذایی، گوشت خوك منشأ اصلی انتقال این سویه ها بـه انسـان گـزارش شـده اسـت. البته آلودگی شیرهاي خام و پنیرهاي سنتی با سویه هاي بیماريزاي یرسـینیا انتروکولیتیکـا در سرتاسر دنیا و از جمله در ایران گزارش گردیـده اسـت.
از سوي دیگر، با ردیابی یرسینیا انتروکولیتیکـا در شـــیرهاي پاســـتوریزه، احتمـــال عـــدم کفایـــت پاستوریزاسیون و یا بـروز آلـودگی ثانویـه مطـرح شـده است. در نتیجه خطر ابتلاي انسان از طریق مصرف شـیر و فـرآورده هـاي حـرارت دیـده نیـز منتفـی نمـی باشـد.

پنیــر فراپالایشــی

پنیــر فراپالایشــی از شــیر پاســتوریزه ( ۷۲درجــه سلسیوس به مدت ۱۵ثانیه) گاوي و متعاقب فراپـالایش تهیه میشـود. پنیر فراپالایشی داراي حداقل ۳۴ درصد مـاده خشـک، ۱۵درصـد چربـی، ۱۱درصـد پـروتئین و pH آن در بـازه ۴/۶-۴/۸ مـی باشـد.


مقدار نمک پنیـر فراپالایشـی ۲تـا ۴ درصـد اسـت کـه به صورت خشک به لخته اضافه میشـود. پنیر فراپالایشی پس از طـی دوره گرمخانـه گـذاري ( در ۲۷ درجه سلسیوس به مـدت ۱روز) و دوره نگـهداري ( در ۸درجه سلسیوس به مدت ۱تا ۲هفته) به بازار عرضـه میگردد.
در طی فرایند فراپالایش شـیر، غلظـت پـروتئین هـاي سرمی در رتنتیت افزایش یافته و منجر بـه بالا رفتن ظرفیت بافري رتنتیت میشود. در نتیجه رشـد و فعالیت باکتريهاي لاکتیکی و به تبع آن نزول pH بـه کنــدي صــورت مــیگیــرد .
به علاوه، محدود بودن دوره گرمخانه گذاري پنیر فراپالایشی به  ۲۴ساعت، فرصت کافی براي فعالیت کشت آغـازگر لاکتیکـی فـراهم نمـی آورد. لـذا، در صورت موثر نبودن فرایند پاستوریزاسیون و یـا آلـودگی ثانویه، خطر رشد میکروب هاي بیماريزا و عامـل فسـاد به ویژه انواع سرماگراي مقـاوم بـه اسـید و نمـک ایجـاد میشود. در این مطالعه، رفتار سویه هاي مختلف یرسـینیا انتروکولیتیکا طی روند تهیه و نگهداري پنیر فراپالایشی و کفایت کشت آغازگر لاکتیکی در مهار بـاکتري مزبـور مورد ارزیابی قرار گرفت.

مواد و روشها

– سویه هاي یرسینیا انتروکولیتیکا

جهت ارزیابی تفاوت هاي احتمالی در رفتار سویه هاي مختلف یرسـینیا انتروکولیتیکـا در پنیـر فراپالایشـی، دو سویه استاندارد این باکتري با کد  DSM 11502و ۹۴۹۹  (DSMZ, Germany) DSM و هـمچنـین یـک سـویه بومی که از پنیر محلی منطقه آذربایجان شرقی جداسـازي شده بود براي تلقـیح استفاده گردید. قابلیت بیماريزایی سـویه هـاي یرسـینیا انتروکولیتیکا با ردیـابی ژن مورد بررسی قرار گرفت. سـویه هـاي باکتریـایی طــی دو مرحلــه متــوالی در محــیط آبگوشــت BHI فعالسازي ( ۲۹درجـه سلسـیوس به مدت  ۲۴ساعت) گردید. کشت هاي ذخیره در دمـاي ۴ درجـه سلسـیوس نگـهداري شـد و یـک روز قبـل از تلقیح در محیط آبگوشت   BHI تجدید کشـت داده شـد.

– تهیه دوز تلقیحی یرسینیا انتروکولیتیکا

جمعیت یرسینیا انتروکولیتیکادر کشت اولیه بـا روش اسـپکتروفتومتري و بـا طـول مـوج  ۵۸۰ نـانومتر تعیـین گردیــد. ســلول هــاي باکتریــایی بــا سانتریفیوژ با شدت  ۴۰۰۰ gو مدت  ۲۰دقیقـه رسـوب داده شدند و سپس با افـزودن سـرم رینگـر اسـتریل تـا رسیدن به تعداد تقریبی۳ واحد لگاریتمی در هر گرم از رتنتیت رقیق سازي گردید.

– تهیه پنیر فراپالایشی

براي تهیـه نمونـه هـاي پنیر فراپالایشی از رتنتیـت پاستوریزه ( ۷۲درجه سلسیوس و  ۱۵ثانیـه) بـا فـاکتور تغلـیظ  ۵/۱اسـتفاده گردیـد. رتنتیـت از کارخانـه شـیر پاستوریزه پگاه آذربایجان شرقی و مشابه با ترکیب مـورد استفاده براي تهیه پنیر فراپالایشی تـأمین شـد. قبـل از تلقـیح، رتنتیـت از نظـر عـدم وجـود آلـودگی یرسـینیا انتروکولیتیکا با روش کشـت مسـتقیم ارزیـابی گردیـد.

به علاوه، به منظور جلوگیري از اثرات مهـاري ترکیبـات آنتیبیوتیکی بر یرسینیا انتروکولیتیکاو نیز فعالیت کشت آغازگر، رتنتیت از نظر عدم آلودگی با ایـن ترکیبـات بـا آزمــون کــوپن مــورد آزمایش قرار گرفت. سپس رتنتیت به طـور جداگانـه بـا تعداد  ۳واحد لگاریتمی به ازاي هـر گـرم )(Log cfu/g از هـر یـک از سـویه هـاي اسـتاندارد و بـومی یرسـینیا انتروکولیتیکا تلقیح شد. مطـابق دسـتورالعمل تهیـه پنیر فراپالایشی سفید ایرانـی، کشـت آغـازگر بـاکتريهـاي مزوفیل لاکتیکی هوموفرمانتـاتیو به نمونه هاي داراي کشـت آغـازگر (بـه مقـدار  ۱۰۰گـرم بـه ازاي  ۵۰۰۰کیلـوگرم رتنتیت) اضافه گردید. کشت آغازگر شامل مخلـوطی ازباکتري هـاي لاکتوکوکـوس لاکتـیسزیرگونـه لاکتـیس لاکتوکوکـوس لاکتـیس زیرگونــه کرمـوریس  ، لاکتوباسـیلوس دلبروکـی زیرگونـه بولگـاریکوس و اســــــترپتوکوکوس ترموفیلــــــوس  بود. سپس مقدار ۲۰۰ گرم از مخلوط رتنتیت و کشت آغازگر به ظـروف پنیر فراپالایشی انتقال یافت و رنت به مقـدار  ۰/۰۰۲درصد )وزنی-وزنـی( بـه مخلـوط اضـافه شـد.

لخته شدن پنیر فراپالایشی

مرحله لخته شدن پنیر فراپالایشی در دماي  ۳۰درجه سلسـیوس بـه مـدت  ۲۰ دقیقـه انجـام گرفـت. سـطح لختـه بـا کاغـذ مخصــوص ) Parchment paper) پوشــانده و پــس از افزودن   ۲درصـد نمـک بـر روي کاغـذ، درب ظـروف مسدود گردید. نمونه هـاي پنیـر بـه مــــدت  ۱روز در دمــــاي  ۲۷ درجــــه سلســــیوس گرمخانه گذاري شد و سپس تـا روز  ۶۰در سـردخانه ۸ درجـه سلسـیوس نگـهداري گردیـد.

– طرح مطالعه

شش نوع پنیر فراپالایشی با در نظر گـرفتن اسـتفاده یـا عـدم اسـتفاده از کشـت آغـازگر و همچنین نوع سویه یرسـینیا انتروکولیتیکـا تهیـه گردیـد. تعداد  ۹نمونه از هر نوع پنیر ساخته شد و طـی مراحـل زیر مورد ارزیابی قرار گرفت:

  • سـاعت صـفر (زمـان تلقیح) ؛
  • روز ۱(پس از گرمخانه گـذاري)؛
  • روز ۵ (انتهــاي دوره قرنطینــه و زمــان عرضــه بــه بــازار)؛
  • روزهــاي  ۵۰ ،۴۰ ،۳۰ ،۲۰ ،۱۰و  ۶۰ (طــی نگــهداري)؛

آزمایشهاي میکروبی (شـمارش یرسـینیا انتروکولیتیکـا، لاکتوکوکوسها و لاکتوباسـیلوسهـا) و شـیمیایی )،pH درصد نمک و رطوبت) در زمان هاي یاد شـده بـر روي نمونه هاي پنیر انجام گرفت. این مطالعه سـه بـار و طـی روزهاي مجزا تکرار گردید.

آزمون هاي میکروبی و شیمیایی

جهت شمارش یرسینیا انتروکولیتیکـا از روش کشـت سطحی در محیط ( پایه) جامد انتخـابی CIN agar base و با افزودن مکمل آنتـیبیـوتیکی( (Merck, Germany Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin استفاده شد.

مقــدار ۱۰ گــرم از نمونه هاي پنیر فراپالایشی متعاقب همگـن سـازي، بـا  ۹۰میلـیلیتـر محلــول هضــم پنیــر ( ۱درصــد کــازیتون و  ۲درصــد سیتراتسـدیم) مخلـوط گردیـد و لولـه هـاي رقـت بـا استفاده از آب پپتونه  ۰/۱درصد استریل از رقت  ۱۰ تـا ۱۰-۸  تهیه شد.

مقـدارتهیـه شـد۱/۰ میلیلیتر از هر رقت بر روي  CINآگار کشت داده شـد. پلیت ها در  ۲۷درجـه سلسـیوس بـه مـدت  ۴۸سـاعت گرمخانه گذاري گردید. سپس پرگنه هاي داراي قطر ۱-۲ میلیمتر، با مرکز قرمز رنگ و پیرامون بیرنگ شـمارش شد.

پـس از ۲۰ روز دوره نگــهداري، در نمونــه هــایی کــه تعــداد یرســینیا انتروکولیتیکا به کمتر از حد قابل شمارش رسیده بود، از نمونه تغلیظ شده استفاده گردید. بـراي ایـن منظـور ۱۰میلیلیتـر از سوسپانسـیون اولیـه در لولـه هـاي فـالکون استریل و در سانتریفیوژ با شتاب  ۴۰۰۰ gبه مـدت ۱۵دقیقه رسوب داده شد. رسـوب بـه دسـت آمـده بـا ۰/۱ میلیلیتر محلول آب پپتونه استریل مخلـوط گردیـد و در محیط کشت CIN agar  کشت داده شد. در نهایت نسبتی از پرگنه هاي شمارش شده با  PCRتأیید گردید.

شمارش باکتري هاي کشت آغازگر

براي شمارش باکتري هاي کشت آغازگر از محیط هاي کشت انتخـابی  MRSآگـار بـراي لاکتوباسـیلوس هـا و M17آگار براي لاکتوکوکـوس هـا استفاده گردید. مقدار  ۰/۱ میلیلیتـر از هـر لولـه سـریال رقت به محیط کشت هاي مزبور منتقل و کشت سـطحی انجــام گرفــت. لاکتوکوکــوس هــادر دمــاي  ۳۰درجــه سلســیوس بــه مــدت  ۳روز تحــت شــرایط هــوازي گرمخانه گذاري شدند. گرمخانه گذاري لاکتوباسیلوس هـا در دماي  ۳۵درجه سلسیوس در جار بیهـوازي حـاوي گاز پک نـوع  (Merck, Germany) Cبـه مـدت  ۳روز انجـام گرفـت.

ویژگـی هـاي شیمیایی نظیر  ،pH درصد نمـک و رطوبـت بـر اسـاس روش  AOACتعیین گردید .

– تأیید یرسینیا انتروکولیتیکا با  PCR

در پلیت هـاي اسـتاندارد مجـذور تعـداد پرگنـه هـاي شمارش شـده ( مـثلاً  ۱۰پرگنـه از مجمـوع  ۱۰۰ پرگنـه شمارش شده) یرسینیا انتروکولیتیکا با   PCRارزیابی شد.

بــراي ایــن منظــور، ژن   ailکــه در کرومــوزوم تمــامی سویه هاي بیماري زاي یرسینیا انتروکولیتیکا حضور دارد،به عنوان ژن هدف انتخاب و از پرایمرهاي ۹A: 5-GTT TAT CAA TTG CGT CTG TTA ATG TGT 10A: 5-CTA TCG AGT TTG GAG  وACG-3  TAT TCA TAT GAA GCG-3 اسـتفاده گردیـد.

هر پرگنه یرسینیا انتروکولیتیکادر میکروتیوب حـاوي  ۲میلیلیتر آبگوشـت   BHIکشـت داده شـد ( ۲۹درجـه سلسیوس و  ۲۴سـاعت). پـس از سـانتریفیوژ کـردن و جداسازي سـلول هـاي بـاکتري ( ۶۰۰۰ gو  ۱۰دقیقـه)، DNA ژنــومی مطــابق بــا روش یــک مطالعــه قبلــی اسـتخراج گردیـد و سپس با استفاده از فنـول- کلروفـرم-ایزوآمیـلالکـل بـا نسبت ۲۵:۲۴:۱ خالص سازي شد.

در نهایـــت  ۵۰میکرولیتـــر آب یـــونزدایـــی شـــده  بــرروي (Deionized water ) عــاري از DNA/RNA بر روی  DNAاضــافه گردیــد.

غلظـــت و خلــــوص DNA اسـتخراج شــده بــا نـانودراپ  و به ترتیب با طـول مـوج   ۲۶۰نـانومتر و نسـبت  ۲۶۰/ ۲۸۰ارزیـابی شـد. مخلـوط واکـنش شـامل ۱۲/۵ میکرولیتـر مسـترمیکس ×۲، و ۶۰ پیکومول از هر پرایمر و ۲۵ نانوگرم   DNAالگو بود.

حجم نهایی مخلوط با افـزودن آب یـــون زدایـــی شـــده عـــاري از  DNAوRNA بــه  ۲۵میکرولیتــر رســید. واکنش   PCR با یک مرحلـه دمـایی  ۹۴ °Cبـه مـدت ۴ دقیقه براي دناتوراسیون اولیـه آغـاز گردیـد. سـپس ۳۵ سیکل متوالی شـامل  ۹۴ °Cبـه مـدت  ۳۰ ثانیـه جهـت دناتوراسـیون،  ۶۰ °Cبـه مـدت  ۱دقیقـه بـراي اتصـال پرایمرها و ۷۲ °Cبه مدت  ۱دقیقه جهت توسعه تـوالی هدف و در نهایت یک مرحله دمایی  ۷۲ °Cبه مـدت ۵ دقیقـه بـراي توسـعه نهـایی اعمـال گردیـد.

محصـول PCR شــامل یــک قطعــه  ۴۵۴ bpبــود کــه متعاقــب الکتروفورز در ژل آگارز  ۱درصـد حاوي  ۰/۱میکروگـرم در میلـیلیتـر رنـگ سـایبرگرین وجود این باند ارزیابی گردید.

– تجزیه و تحلیل آماري

نتــایج حاصــل از شــمارش یرســینیا انتروکولیتیکــا و باکتريهاي کشت آغازگر به مقیاس لگـاریتمی تبـدیل و مورد تجزیه و تحلیل آماري قرار گرفت. نرمــال بــودن توزیــع داده هــا بــا آزمــونهــاي Skewness و  Kurtosis بررسی گردیـد. پـس از انجـام آمــار توصــیفی (میــانگین و انحــراف معیــار) بــر روي داده هاي مطالعه، تغییرات تعداد یرسینیا انتروکولیتیکـا در طی مراحل مختلف تهیه و نگهداري پنیر در هر گـروه از داده ها و همچنین تفاوت تغییـرات سـویه هـاي مختلـف یرسینیا انتروکولیتیکابـا آنـالیز واریـانس و آزمون دانکـن  مقایسـه گردیـد. بـراي مقایسه بین گروهی (نمونه هاي دارا و فاقـد آغـازگر) از آزمــون مســتقلT  استفاده شد.

یافته ها

تغییــرات جمعیــت ســویه هــاي مختلــف یرســینیا انتروکولیتیکــا طــی مراحــل تهیــه و نگــهداري پنیــر فراپالایشـی نشـان داد که بـر اساس این نتایج، جمعیت یرسینیا انتروکولیتیکا از زمـان تلقیح تا روز  ۱(گرمخانه گذاري) در نمونه هـاي حـاوي کشت آغازگر و فاقد آن بـه طـور میـانگین  ۴/۱۴واحـد لگاریتمی افزایش یافت. اما پس از طی ایـن دوره به تدریج تعـداد ایـن بـاکتري در هـر دو گـروه از نمونه ها کاهش پیدا کرد. این میزان کاهش تا روز  ۵ فقط ۰/۳۸ واحد لگاریتمی برآورد گردید کـه از نظـر آمـاري معنــی دار نبــود.

در دوره نگــهداري تعــداد یرســینیا انتروکولیتیکــا در نمونــه هــاي فاقــد آغــازگر کــاهش چشمگیري نشان نداد و در انتهاي دوره  ۶۰روزه تعـداد ۷/۳۳ واحد لگاریتمی یرسینیا انتروکولیتیکا در هـر گـرم از پنیر ردیابی شـد. در حـالی کـه در نمونـه هـاي داراي آغازگر تعداد این بـاکتري در هـر مقطـع زمـانی از دوره نگــهداري، بــه طــور معنــیداري کمتــر از نمونه هاي فاقد آغازگر بود. طـوري کـه در انتهـاي دوره ۶۰روزه نگــهداري صــرفاً  ۳/۳۲واحــد لگــاریتمی از بــاکتري زنــده در هــر گــرم پنیــر شــمارش گردیــد.

در نمونه هاي فاقد آغـازگر، سـویه هـاي اسـتاندارد  DSM و بـومی یرسـینیا انتروکولیتیکـا رفتار مشابهی نشان داده و با تفاوت مختصري، تـا پایـان دوره  ۶۰روزه نگهداري بقاي خود را حفظ نمودنـد. در حالیکه در نمونه هاي داراي آغازگر سویه بومی یرسـینیا انتروکولیتیکا در قیاس با سویه هـاي اسـتاندارد پایـداري بیشتري داشـت. رفتـار سـویه هـاي مختلـف تـا روز ۱۰نگهداري مشابه برآورد گردیـد، امـا از روز  ۲۰ تـا پایـان مــدت نگــهداري تفــاوت معنــیداري در جمعیت سویه بومی بـا سـویه هـاي اسـتاندارد مشـاهده گردید. در انتهاي دوره نگهداري، تعـداد سـویه بـومی و میانگین دو سویه هاي استاندارد بـه ترتیـب  ۴/۷۴و ۲/۶۱ واحد لگاریتمی در هر گرم تعیین گردید.

میــانگین تغییــرات بــاکتريهــاي آغــازگر لاکتیکــی (لاکتوباسیلوس هـا و لاکتوکوکـوس هـاي مزوفیـل) طـی مراحل مختلف تهیه، گرمخانه گـذاري و نگـهداري پنیـر سفید فراپالایشی تعیین گردید.

شمارش بـاکتريهـاي لاکتیکـی

شمارش بـاکتريهـاي لاکتیکـی نشـان داد پـس از دوره گرمخانه گذاري (روز  ۱) در نمونـه هـاي حـاوي کشـت آغازگر، لاکتوباسیلوس ها و لاکتوکوکوس ها در حـدود ۱ واحد لگاریتمی در هر گـرم افـزایش یافـت. ایـن رونـد افزایشی طـی روزهـاي  ۵ و ۱۰نگـهداري نیـز مشـاهده گردید و در روز  ۱۰ بالاترین جمعیت لاکتوباسیلوس هـا و لاکتوکوکوس هـا بـه ترتیـب و بـا تعـداد  ۹/۶۱و ۹/۳۴ واحد لگاریتمی در هر گرم پنیر به دست آمد.

اما متعاقـب روز  ۱۰و تـا انتهـاي دوره نگـهداري رونـد نزولی در جمعیت باکتريهاي آغازگر مشـاهده گردیـد. شمارش باکتريهاي لاکتیکی در نمونه هاي فاقـد کشـت آغازگر حـاکی از حضـور تعـداد میـانگین  ۱/۳۷واحـد لگاریتمی لاکتوباسیلوس و لاکتوکوکوس در هر گـرم از رتنتیت بود. این گروه جزو بـاکتريهـاي لاکتیکـی شـیر خام هستند که شرایط پاستوریزاسیون و سایر فرایندهاي تهیه پنیر سفید فراپالایشی را تحمـل نمـوده انـد. پـس از گرمخانه گـذاري ایـن مقـدار بـه طـور تقریبـی  ۲واحـد لگاریتمی افزایش یافت و در روزهـاي  ۳۰و ۴۰دوره نگـــهداري جمعیـــت لاکتوباـیلوس ها و لاکتوکوکوس ها به ترتیب به حداکثر تعـداد  ۴/۱۴و ۴/۴۵ واحد لگاریتمی در هر گرم رسید.

براساس نتایج، در نمونـه هـاي داراي آغـازگر میزان  pH در پایان دوره گرمخانه گذاري به  ۴/۸۰کاهش یافت که از نظر آماري معنی دار بـود. امـا در ادامه دوره نگهداري تغییـرات معنـیداري در مقـدار pH مشاهده نشد. در نمونه هاي فاقد آغازگر تغییـرات   pHاز زمان تهیه پنیر تا انتهاي دوره نگهداري غیرمعنی دار بـود.

نتــایج تغییــرات درصــد نمــک و رطوبت نمونه هاي پنیر بـا توجـه به اینکه تفاوت معنی داري از نظر خصوصـیات شـیمیایی بین گروه هاي داراي و فاقـد آغـازگر مشـاهده نگردیـد، میانگین نتایج هـر دو گـروه بـه عنـوان درصـد نمـک و رطوبت در نظر گرفتـه شـد. طبـق ایـن نتـایج، تفـاوت معنی داري در میزان این پارامترها طی دوره هاي مختلـف تهیه و نگهداري پنیر مشاهده نشد.

بحث و نتیجه گیري

حضور بـاکتريهـاي بیمـاريزا در مـواد غـذایی و ورود آنها به بدن، به ویژه در کودکان، سالمندان و افـراد با ضعف سیستم ایمنی میتواند عوارض شـدید و حتـی مرگبار به دنبال داشته باشد. با توجه به اهمیـت تغذیـه اي شیر و فـرآورده هـاي آن و مصـرف ایـن محصـولات از سوي افراد مختلف، کیفیت و استاندارد بـالاي بهداشـتی آن از پیشنیازهاي این گروه از مـواد غـذایی اسـت. در همین راستا، طی مطالعات تلقیحی متعددي رشد و بقاي میکـروبهـاي بیمـاريزا در فـرآورده هـاي شـیر مـورد بررســـی قـــرار گرفتـــه اســـت.

در مطالعــه اخیــر، بــا مقایســه تعــداد یرســینیا انتروکولیتیکادر نمونه هاي حاوي کشت آغازگر و فاقـد آن، می توان به تفاوت قابل ملاحظه در تعـداد این باکتري پی برد. برآورد جمعیت باکتريهاي لاکتیکی نشـان داد، متعاقـب گرمخانـه گـذاري جمعیـت کشـت آغازگر افزایش یافته و به تبع آن  pHنمونه ها بـه حـدود ۴/۸۰کــاهش یافــت. از ایــن مرحلــه بــه بعــد تفــاوت چشمگیري در تعداد یرسینیا انتروکولیتیکابین نمونه هاي داراي آغازگر نسـبت بـه نمونـه هـاي فاقـد آن مشـاهده گردید.

مهمترین دلیل کـاهش تعداد یرسینیا انتروکولیتیکا

بر اساس شواهد موجود به نظر می رسد فعالیـت کشت آغازگر و افت  pH به عنوان مهمترین دلیل کـاهش تعداد یرسینیا انتروکولیتیکا در نمونه هـاي داراي آغـازگر باشـد. دلایـل مشـابهی در مطالعـات متعـدد بـراي ایـن موضوع مطرح شده است. ارکمن در مطالعـه اي فعالیـت کشت آغازگر به همراه افـزودن نمـک را دلایـل کـاهش تعداد یرسینیا انتروکولیتیکا در پنیر فتاي ترکیه  مطرح نمود. این روند نزولی به مـوازات سپري شدن دوره رسیدن پنیر و کاهش  pHاتفـاق افتـاد.

در مطالعه دیگري اثر لاکتوباسـیلوس بولگـــاریکوسو اســـترپتوکوکوس ترموفیلـــوس بـــر ماندگاري یرسینیا انتروکولیتیکا در پنیر سفید ایرانی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج به دست آمده هم خوانی بالایی با نتایج این مطالعه داشت. به این معنی که بـاکتريهـاي لاکتیکی با کاهش  pHپنیر موجـب مهـار رشـد و بقـاي یرسینیا انتروکولیتیکا گردید.

مطالعات تلقیحـی

در مطالعات تلقیحـی انجـام یافتـه در پنیـر فراپالایشـی، بقاي میکروب هاي مختلف مـورد ارزیـابی قـرار گرفتـه است. نتایج حاصل، بیانگر شباهت ها و تفـاوت هـایی بـا آن چه که در مطالعه اخیر به دست آمده است، می باشـد. براي مثال استافیلوکوکوس اورئـوسرفتـار مشـابهی بـا یرسینیا انتروکولیتیکا در واکنش به کاهش  pHنشـان داد.

در حـالی کـه مایکوباکتریوم اویوم پاراتوبرکلوزیسنه تنهـا طـی دوره گرمخانه گذاري، بلکـه تـا روز  ۳۰ دوره نگـهداري هـیچ کاهشـی در نتیجـه نـزول  pHنشـان نـداد به نظر مـیرسـد تفـاوت در رفتـار میکـروبهـا می تواند بـه توانـایی آنهـا در تحمـل شـرایط نامسـاعد محیطی و از آن جمله تفاوت در حساسـیت نسـبت بـه pH باشد.

درجـات متفـاوتی از مقاومت در برابـر عوامـل نامسـاعد

براساس یافته هاي این مطالعه، درجـات متفـاوتی از مقاومت در برابـر عوامـل نامسـاعد در بـین سـویه هـاي استاندارد و بومی یرسینیا انتروکولیتیکـا مشـاهده گردیـد. به نظر میرسد سـویه هـاي وحشـی یرسـینیا انتروکولیتیکـا در مقایسـه بـا سـویه هـاي آزمایشـگاهی پایداري بیشتري در برابر اسـترس هـاي محیطـی داشـته باشند. پدیده (محافظـت متقـاطع)

مناسب ترین توجیهی است که میتوان براي این موضوع مطرح نمود. به این معنی که در معرض قرارگیـري یـک ارگانیسم با تنش هاي محیطی، منجر به فعال شدن برخی ژن هاي مقاومـت شـده و در نتیجـه ارگانیسـم در برابـر استرس هاي بعدي پایدارتر میگردد. سویه بومی یرسینیا انتروکولیتیکا از جدایـه هـایی انتخـاب گردیـد کـه طـی مطالعـه هاي از پنیـر سـنتی لیقـوان جداسـازي شـده بـود.

با توجـه بـه ایـنکـه شرایط داخلـی پنیـر لیقـوان از نظر اسیدیته، درصد نمک (فشار اسمزي) و حضور فلور میکروبی رقیب با قابلیت تولیـد ترکیبـات آنتاگونیسـتی، شرایط دشوارتري در قیاس بـا محـیط پنیـر فراپالایشـی براي میکروب ها ایجاد میکند، لذا در چنین محیط هـایی باکتريهـا بـا واسـطه محافظـت متقـاطع جمعیـت هـاي مقاومتري بـراي تحمـل تـنش هـاي محیطـی بـه وجـود مـی آورنـددر مقابل سویه هاي استاندارد شامل باکتريهـاي هستند که در نتیجه رشد در شـرایط آزمایشـگاهی و بـه دور از تنش هاي محیطی به تدریج قابلیت هاي خـود را از دست میدهند.

در این مطالعه تکثیر سریع یرسینیا انتروکولیتیکا طی دوره گرمخانه گذاري نشان مـیدهـد، در صـورت بـروز آلودگی ثانویه در حین تولید و بسته بندي، باکتري مزبور امکان رشد و تکثیر سریع را خواهد داشـت کـه از ایـن نظر یک مخاطره بهداشتی محسوب میگردد. به علاوه بـا وجود اثر مهاري کشت آغازگر، تمامی سویه هاي یرسینیا انتروکولیتیکا بقاي خود را تا پایان دوره نگهـداري پنیـر فراپالایشی حفظ نمودند. در نتیجه این باکتري بـه عنـوان خطر بالقوه در ارتباط بـا مصـرف پنیرهـاي فراپالایشـی است که دچار آلودگی ثانویه شده اند و یا احتمالاً فرآیند پاستوریزاسیون به طور مؤثر بـرروي آنهـا اعمـال نشـده است. با عنایت به اینکه جمعیت بـاکتري هـاي آغـازگر طــی گرمخانــه گــذاري پنیــر فراپالایشــی افــزایش قابـــل ملاحظـــه اي نداشـــت، لـــذا اســـتفاده از دوره گرمخانه گذاري طولانیتر مـیتوانـد بـر میـزان رشـد و فعالیت کشـت آغـازگر و بـه تبـع آن در تولیـد اسـید و ترکیبــات آنتاگونیســتی مــوثر باشــد. در نهایــت بــراي دستیابی به محصولی با کیفیت بهداشتی بالاتر و ایجـاد حاشــیه امنیــت بــراي مصــرف کننــدگان، مــیتــوان از کشت هاي آغازگر با قابلیت تولیـد باکتریوسـین هـا و یـا توانایی رشد در دماهاي پایین تر بهره برد.

این تحقیق توسط پژوهشگران گروه علوم و صنایع غذایی، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز  انجام گرفته است. با تشکر از زحمات این عزیزان.

رسینیا انتروکولیتیکا
خمیر پیراشکی فلفلی تکین
خمیر پیراشکی زعفرانی تکین
خمیر پیراشکی ساده تکین
پنیر پیتزا رنده 2 کیلویی (ظرف) تکین
پنیر پیتزا ورقه 400 گرمی تکین
پنیر پیتزا پروسس ورقه ای 180 گرمی تکین
خمیر پیتزا مینی تکین
پنیر پیتزا یک کیلویی سوپر مارکتی رویال
پنیر پیتزا 180 گرمی تکین
پنیر پیتزا دو کیلویی تکین
تاپینگ پیتزا دانمارکی تکین
تاپینگ پیتزا ویژه تکین
تاپینگ پیتزا اسنکی تکین
خمیر پیتزا زعفرانی تکین
خمیر پیتزا ساده تکین
IMG_8230
خمیر پیراشکی فلفلی تکین