کلیفرم ها متعلق به خانواده انتروباکتریاسه، باسیلی شکل، بیهوازی اختیاری با اپتیمم دمای رشد ۳۷درجه سلسیوس، کاتالاز مثبت، اکسیداز منفی و با توانایی تخمیر لاکتوز و تولید اسید و گاز از آن می باشند. ما در این پژوهش به بررسی میزان آلودگی، تنوع گونه اي و قابلیت تولید بیو فیلم کلیفرم هاي جدا شده از بیوفیلم مخازن حمل شیر خام و تجهیزات فرآوري محصولات شیر می پردازیم.
آنچه در این مطلب می‌خوانید:
کلیفرم چیست؟
اصطلاح کلیفرم برای باکتری های باسیلی، گرم منفی و فرمانتاتیو گفته می شود که به صورت فراوان در مدفوع حیوانات خون گرم یافت می شوند هرچند کلیفرم ها به راحتی قابل تشخیص می باشند، ولی نمی توان به طور قطعی حضور آنها را شاخصی برای آلودگی به مدفوع دانست؛ زیرا تعدادی از کلیفرم ها به طور طبیعی در محیط، آب، خاك و در سبزی ها یافت می شوند. کلیفرم ها شامل جنس های انتروباکتر، سیتروباکتر، کلبسیلا و اشریشیا می باشند. این میکروارگانیسم ها اساساً بیماریزا نیستند، اما برخی از گونه های اشریشیا کولای مولد بیماری اند.
اشریشیا کولای
اشریشیا کولای سروتیپ O157:H7یکی از عوامل اصلی ایجادکننده عفونت غذایی و بیماریهایی نظیر اسهال خفیف، کولیت خونریزی دهنده، سندرم همولیتی کاورمیک و مرگ در انسان است. کلیفرم های مدفوعی عمدتاً شامل سویه های اشریشیا کولای است اما بعضی از باکتری های روده ای همچون کلبسیلا نیز می تواند جزو کلیفرم های مدفوعی تلقی شود. معمولاً پس از پاستوریزاسیون جمعیت کلیفرم ها به صفر می رسد و در مواقعی، چند عدد کلیفرم در شیر پاستوریزه مشاهده می گردد، که احتمالاً عوامل مؤثر شامل ناکافی بودن فرآیند حرارتی، آلودگی ثانویه، شستشوی ناکافی تانک های ذخیره و غلظت نامناسب سود و اسید باشد.
این میکروارگانیسم ها از طریق نوك پستان، سطوح خارجی پستان، تجهیزات حملونقل و شیردوشی، تانک های حمل شیر، به شیرخام منتقل می شوند و در اثر فرآیند پاستوریزاسیون غیرفعال میگردند، بنابراین حضور آنها در شیر پاستوریزه شاخصی از آلودگی پس از فرآیند می باشد.
به دلیل پراکندگی بالای کلیفرم ها در طبیعت و بدن حیوانات، آلودگی شیر توسط این میکرواورگانیسم ها بسیار محتمل است. برخی از جنس های کلیفرم علاوه بر ایجاد فساد در فرآورده های شیر، بیماریزای انسانی نیز هستند. در بخش هایی از کارخانه که فاقد وضعیت بهداشتی مناسبی می باشد، تعداد اولیه این ارگانیسم ها بسیار بالاست و همین امر احتمال ورود آنها را به فرآورده های شیر افزایش می دهد. بسیاری از کلیفرم ها آنزیم های خارج سلولی تولید می کنند و در اثر تخریب ترکیبات تشکیل دهنده شیر، ماندگاری فرآورده های شیر را کاهش می دهند.
از طرفی، این میکروب ها قابلیت چسبیدن و تشکیل بیوفیلم بر روی سطوح مختلف را دارند و در نتیجه مقاوم شدن در برابر عوامل ضدمیکروبی و ضدعفونی کننده ها، به یک معضل بهداشتی در صنایع شیر تبدیل شده اند .
بیوفیلم به تجمع میکروارگانیسم هایی گفته می شود که به سطوح متصل شده و رشد میکنند. مراحل تشکیل بیوفیلم شامل اتصال اولیه؛ اتصال غیرقابل برگشت؛ توسعه اولیه ساختار بیوفیلم؛ تکمیل ساختار و پخش شدن میکروارگانیسم هاست. شکل گیری و توسعه بیوفیلم تحت تأثیر عوامل متعددی از نظیر جنس و گونه باکتری، ویژگی سطوح، پارامترهای زیست محیطی مانند ،pH غلظت مواد مغذی و درجه حرارت رشد می باشد.
ساختار بیوفیلم طوری است که باکتری را در برابر تنش های محیطی حفاظت میکند به گونه ای که سلول های بیوفیلم در مقابل عوامل ضدمیکروبی در مقایسه با باکتری پلانکتونی مقاومتر هستند زیرا دارای حفاظ خوبی از انواع میکروب ها هستند که موجب جلوگیری یا کاهش تماس با عوامل ضدمیکروبی می شود. در نتیجه بیوفیلم در صنایع شیر، فرآوری ماهی، مرغ، گوشت و غذاهای آماده به یک مشکل اساسی تبدیل شده است.
تشکیل بیوفیلم علاوه بر داشتن تبعات بهداشتی، از طریق مسدودکردن لوله ها در مبدل های حرارتی و برج های خنک کننده در کارخانجات فرآوری محصولات شیر، میزان انتقال حرارت را به طور قابل توجهی کاهش می دهد و نیز سبب تجزیه و پوسیدگی غشاهای فراپالایش مورد استفاده در تولید پنیر و اسمز معکوس می شود.
در مطالعات انجام شده، باکتریهای متنوعی نظیر سودوموناس، آیروموناس، استافیلوکوکوس، باسیلوس ها، باکتریهای لاکتیکی، خانواده انتروباکتریاسه و لیستریا، از نظر تولید بیو فیلم در بخش های مختلف کارخانه های فرآورده شیر، مورد مطالعه قرار گرفته اند. بر اساس یافته های این مطالعات، مخازن حمل شیر خام، تانک بالانس، دستگاه هواگیر، شیرآلات و دریچه ها، قسمت های لاستیکی تجهیزات، غشاهای فراپالایش و دستگاه های پرکن مهمترین بخشهایی بودند که آلودگی بیوفیلم میکروبی داشتند.
باکتری های رودهای و کلیفرم ها بیشتر در آب آشامیدنی و سیستم لوله کشی آب شهری مورد بررسی قرار گرفته است. 2013b مطالعات داخلی بر روی بیوفیلم کلیفرم ها نشان داد ۹۸درصد نمونه پنیر تازه لیقوان حداقل به یک نوع از کلیفرم ها آلوده بودند. میزان آلودگی نمونه ها به اشریشیا کولای ،%۵۰ پروتئوس % ،۱۵سالمونلا ،%۱۲سیتروباکتر % ،۹کلبسیلا % ۶و انتروباکتر % ۱به دست آمد. یک تحقیق تجربی نشان داد اشریشیا کولای سروتیپ O111 توانایی تولید بیوفیلم و چسبیدن به سطوح استیل ضدزنگ و پلاستیکی را دارد.
پراکندگی بالای کلیفرم ها در محیط کارخانجات فرآوری شیر و توانایی تشکیل بیوفیلم توسط این ارگانیسم ها بر روی سطوح تجهیزات فرآوری، بسته بندی و نگهداری موادغذایی، اهمیت این گروه از باکتریها را بیشتر آشکار می سازد. هدف این مطالعه بررسی میزان آلودگی و تنوع گونه ای کلیفرم ها در تانکرهای حمل شیرخام و تجهیزات فرآوری و نگهداری فرآورده های شیر و قابلیت کلیفرم ها در تشکیل بیوفیلم می باشد.
روش نمونه گیري و کشت
نمونه برداری از یکی از کارخانه های فرآوری شیر و فرآورده های آن واقع در استان آذربایجان شرقی و طی سال ۱۳۹۵ انجام گرفت. در مجموع ۸۰نمونه، شامل ۳۰ نمونه از مخازن حمل و نگهداری شیر خام، ۳۰ نمونه از تجهیزات فرآوری، نگهداری و بسته بندی محصولات لبنی (خطوط تولید شیر پاستوریزه، شیر استریل، پنیر فراپالایش، دوغ و ماست) و ۲۰ نمونه از سطوح مختلف سالن تولید (نظیر کف سالن تولید، سطح تجهیزات، تسمه های نقاله و)… نمونه گیری صورت گرفت.
به این منظور پس از شستشو در محل (CIP) مخازن و تجهیزات بر اساس دستورالعمل تعریف شده برای این کار نمونه ها با استفاده از برس سیمی استریل و به صورت مکانیکی از روی سطوح تراشیده شد و پس از انتقال به سرم رینگر استریل، در ۴ °Cب ه آزمایشگاه انتقال یافتند. نمونه ها به مدت ۵دقیقه با دور ۴۰۰۰ gسانتریفیوژ گردید و رسوب حاصله در محیط ویولیت رد بایل آگار به صورت پورپلیت کشت داده شد و در دمای ۳۷ °Cبه مدت ۲۴-۴۸ ساعت گرمخانه گذاری گردید. کلونی های به دست آمده تحت آزمون های غربالگری و تأییدی قرار گرفتند.
آزمون هاي غربالگري و افتراقی
ابتدا چند پرگنه با خصوصیات ظاهری متفاوت در محیط کشت عصاره قلب و مغز (Merck, Germany ) به صورت خطی کشت داده شدند تا ضمن احیای باکتری در یک محیط عمومی، از خالص بودن کشت ها اطمینان حاصل شود. در ادامه رنگ آمیزی گرم و آزمون های کاتالاز و اکسیداز بر روی جدایه ها صورت گرفت. برای تشخیص افتراقی گونه های کلیفرم از آزمون های بیوشیمیایی استفاده شد.
قابلیت تولید بیوفیلم
برای تعیین مقدار تولید بیوفیلم تولید شده توسط جدایه ها، از تکنیک «ارزیابی کمی در میکروپلیت» و مطابق با روش سری و همکاران (۲۰۱۳) استفاده شد. بر اساس این روش جدایه ها ابتدا در محیط تریپتیک سوی براث حاوی ۰/۵درصد عصاره مخمر ,Merck Germany به مدت ۲۴ساعت در ۳۷ °C تجدید کشت گردیدند. مقدار ۱۹۰میکرولیتر از محیط تریپتیک سوی براث حاوی ۲ درصد ساکارز و ۲درصد گلوگز به هر گوده میکروپلیت انتقال داده شد و ۱۰ میکرولیتر از کشت تازه جدایه ها در هر گوده تلقیح گردید.
برای نمونه های شاهد منفی از ۲۰۰ میکرولیتر محیط کشت استریل استفاده شد. تمامی جدایه ها و همچنین نمونه شاهد منفی در سه تکرار مورد آزمایش قرار گرفتند. میکروپلیت در دمای ۳۷ °C به مدت ۴۸ساعت گرمخانه گذاری گردید. سپس محتویات آنها تخلیه و ۳ مرتبه با ۲۵۰ میکرولیتر آب یونزدایی شده ( Deionized water) شستشو داده شدند.
برای تثبیت بیوفیلم در داخل گوده ها، مقدار ۲۰۰میکرولیتر متانول ۹۹ درصد به هر گوده اضافه و پس از ۱۵دقیقه، تخلیه و در دمای آزمایشگاه خشک گردید. مقدار ۲۰۰ میکرولیتر کریستال ویوله ۲ درصد به هر گوده اضافه و بعد از ۵دقیقه آبکشی و در شرایط محیطی خشک شد. کریستالویوله باقیمانده با افزودن ۲۰۰ میکرولیتر اسیداستیک ۳۳ درصد به هر گوده حل شد و شدت رنگ ایجاد شده با دستگاه الایزا در طول موج ۴۹۲ نانومتر اندازه گیری شد.
نتایج و بحث
بر این اساس، از ۸۰ نمونه اخذ شده از محل های مختلف، ۷نمونه (%۸/۷۵) آلوده به جنس کلیفرم ها بودند. بیشترین میزان آلودگی از نمونه های محیطی و سطوح مختلف سالن تولید به دست آمد.
نکته قابل توجه در ارتباط با میزان آلودگی کلیفرمی در نمونه های مختلف، عدم وجود آلودگی در تجهیزات فرآوری محصولات شیر بود. با توجه به اینکه در مطالعه حاضر نمونه برداری بعد از CIPانجام گرفت، لذا عدم وجود آلودگی کلیفرم در تجهیزات نشان دهنده کفایت CIP در برطرف کردن این نوع از آلودگی کلیفرمی از تجهیزات می باشد.
با این حال در سایر نمونه ها از جمله کف سالن تولید، سطح تسمه نقاله و زانوی خروجی تانک حمل شیرخام موارد آلودگی یافت شد. در تحقیقات انجام شده بر روی بیوفیلم باکتری های خانواده رودهای در کارخانه جات شیر، بیوفیلم ها در مناطقی مانند تانک بالانس، تسمه نقاله و تانک های حمل شیر خام یافت گردید.
در مورد سایر باکتری ها، موارد متعددی از آلودگی با سودوموناس روسی و همکاران (۲۰۱۸) استافیلوکوکوس اورئوس تیران و همکاران (۲۰۱۸) و کرونوباکتر گوپتا و همکاران (۲۰۱۸) در صنایع شیر گزارش شده است.
بر اساس نتایج آزمون های افتراقی، ۱۶جدایه به دست آمده متشکل از ۴گونه متنوع بودند. بیشترین فراوانی مربوط به جنس های انتروباکتر و کلبسیلا و کمترین میزان فراوانی مربوط به سیتروباکتر بود در بررسی حاضر، با وجود اینکه فقط تعداد محدودی ۸%/۷۵ از نمونه ها آلوده به کلیفرم بودند، اما گونه های متنوعی از کلیفرم ها جداسازی و تشخیص داده شدند. انتروباکتر و کلبسیلا با ،%۳۱/۲۵ اشریشیا با % ،۲۵و سیتروباکتر با %۱۲/۵ یافت شدند.
در همین راستا تحقیقی در آمریکا بر روی تانک های حمل شیر خام انجام شد و از مجموع ۱۳۰نمونه آزمایش شده، ۷۷ نمونه دارای آلودگی کلیفرمی بود و سهم هر یک از کلیفرم های شناسایی شده بهترتیب کلبسیلا ،%۳۶/۴ انتروباکتر ،%۳۲/۵ اشریشیا %۲۲/۱و سیتروباکتر %۹ گزارش شد (جایریو و وانگ ۱۹۹۹).
نکته قابل توجه شباهت زیاد نتایج دو مطالعه از نظر تنوع جنس های کلیفرمی و درصد فراوانی آنها می باشد. بالا بودن فراوانی جنس کلبسیلا ممکن است به دلیل قابلیت تولید کپسول توسط این باکتری و در نتیجه سهولت اتصال آن به سطوح و تشکیل بیوفیلم باشد (رضویلر ۲۰۰۲؛ گوندوگان ۲۰۱۴). در مطالعه دیگری غشای UF مورد استفاده در صنایع شیر، به صورت تجربی با تعداد ۷ واحد لگاریتمی در میلیلیتر از کلبسیلا اکسیتوکا آلوده شد و سپس به طور متداول فرآیند CIP بر روی آن
اعمال گردید.
نتایج نشان داد که CIP موجب حذف کامل بیوفیلم باکتری نمی شود. در این مطالعه مؤثرترین روش برای حذف بیوفیلم استفاده از مخلوط آنزیمی (Quatro Zyme ) معرفی شد، هرچند در پایان همچنان تعداد محدودی از باکتری زنده باقی ماندند. بر اساس یافته های مطالعه، %۸۷/۵ جدایه ها (به جز دو جدایه اشریشیا کولای)، مولد بیوفیلم بودند و مقادیر مختلف بیوفیلم را تولید کردند. در این میان، بیشترین تولید بیوفیلم توسط سیتروباکتر فروندای اندازه گیری شد.
جدایه های مولد بیوفیلم مقادیر متفاوت بیوفیلم تولید نمودند. به طوریکه گونه های اشریشیا کولای، انتروباکتر کلوکا، انتروباکتر ساکازاکی ضعیف و کلبسیلا نومونیه و کلبسیلا ایروجنز متوسط بودند. توانایی تشکیل بیوفیلم نه تنها در بین گونه های مختلف تا حد زیادی متفاوت برآورد شد، بلکه می تواند در میان جدایه های یک گونه نیز به طور قابل توجهی متفاوت بود در بین جدایه ها، سیتروباکتر فروندای مولد قوی بیوفیلم تشخیص داده شد که بیوفیلم معادل(OD = 0/965 ۵/۱۸) برابر نمونه شاهد تولید نمود.
این باکتری از تونل انعقاد پنیر UF و همچنین از کف سالن UHT جداسازی شد. دلیل وجود چنین باکتری هایی وجود درز و شکاف در نواحی مزبور است که محل مناسبی را برای تجمع باقیمانده مواد غذایی و باکتری فراهم می آورد و از طرفی عمل شستشو و ضدعفونی این قسمت ها به طور کامل ممکن نمی باشد. نتایج مشابه توسط روسی و همکاران (۲۰۱۸) و تیران و همکاران (۲۰۱۸) به دست آمد که طی مطالعات آنها میزان آلودگی در سالن تولید و سطوح ناصاف تجهیزات بیشتر از مناطق دیگر نمونه برداری بود.
مطالعات نشان داده است، علاوه بر جنس و میزان صیقلی بودن سطوح و نیز نقاط زاویه دار و بنبست در تجهیزات، عوامل دیگری نظیر حضور ترکیبات مغذی و پیش سازهای سنتز مواد پلیمری، pH محیط و اثرات سینرژیستی میکروب ها، بر مقدار تولید بیوفیلم تأثیرگذار هستند دونلن ( ۲۰۰۲). در مطالعه ای شنگ و همکاران (۲۰۰۸) نشان دادند pH بر تعامل بین سلول های باکتریایی و سطح فلز تأثیرگذار است. به نظر می رسد نیروی چسبندگی باکتری- فلز زمانی به بالاترین مقدار خود می رسد که pH محلول در نزدیکی نقطه ایزوالکتریک باکتری ها باشد و هرچه نیروی چسبندگی بیشتر باشد، باکتری ها با نیروی قوی تری به سطوح خواهند چسبید.
نتیجه گیري
با بررسی محل های شناسایی جدایه ها به خوبی می توان به منابع شایع آلودگی کلیفرمی در کارخانه جات تولید فرآورده های شیر پی برد. وجود نمونه های آلوده فراوان( ۴۳%/۷۵) در کف سالن، نشان دهنده پتانسیل بالای این مکان ها برای آلوده کردن فرآورده های شیر است.
وجود شکاف و درزهای فراوان، حضور باقیمانده مواد آلی – که به کانون تمرکز میکروب ها مبدل می شوند- و عدم توجه کافی کارکنان در شستوشوی و ضدعفونی کف سالن می تواند اصلی ترین دلایل حضور آلودگی در این نواحی باشد. علاوه بر سطوح سالن تولید، تسمه های نقاله (%۳۷/۵) و زانوی خروجی تانک حمل شیر خام (%۱۸/۷۵) از آلودگی بالایی برخوردار بودند.
هنگام شستشو و CIP تانکرهای حمل شیر، ممکن است دسترسی کامل به تمامی سطوح تانکر میسر نباشد و محل های جوشکاری و زانوی خروجی شیر از مکان هایی هستند که به طور موثر ضدعفونی نمی شوند. طوری که در بعضی از تانکرها به وضوح بیوفیلم تشکیل شده قابل مشاهده است. برای رفع چنین بیوفیلم هایی به موازات ،CIP باید از روش های کمکی مکانیکی استفاده شود.
باید به این نکته توجه داشت که آلودگی کلیفرمی می تواند از طریق پرسنل به سالن تولید راه یابد. عدم استفاده از حوضچه های ضدعفونی در ورودی سالن ها و رعایت نکردن بهداشت فردی کارکنان می تواند باعث تشدید آلودگی ها و انتقال آنها به سایر قسمت های کارخانه و محصول تولیدی شود ( سیمویز و همکاران ۲۰۰۶) استفاده از آب پرفشار و با درجه حرارت بالا برای تمیز کردن سطوح می تواند علاوه بر اعمال نیروی فیزیکی لازم جهت رفع مؤثر آلودگی ها در غیر فعال سازی حرارتی و در نتیجه کاهش جمعیت فرم های رویشی میکروب ها نقش داشته باشد.
علاوه بر این، تمیز کردن فقط رفع و جداسازی حدود ۹۰ درصد از باکتری ها از سطوح را امکانپذیر می سازد و ممکن است آلودگی به سطوح دیگر متصل شده و بیوفیلم جدیدی تشکیل دهند. لذا ضدعفونی کردن با هدف از بین بردن کامل عوامل آلوده کننده محیطی ضروری است استفاده از روش های شستشو و ضدعفونی تکمیلی، آموزش کارکنان برای رعایت بهداشت فردی، نظارت بیشتر بر شستوشوی کف سالن، تعویض مصالح آسیب دیده، نظارت بیشتر بر CIP تانکرهای حمل شیر خام و به کارگیری روش های کارآمد می تواند آلودگی های کلیفرمی را تا حدود زیادی کاهش دهد.
مطالب مرتبط:
