B. cereus در شیر و جداسازی و شناسایی آن

۱ خرداد, ۱۴۰۱

B. cereus در شیر و جداسازی و شناسایی آن

جداسازی و شناسایی  Bacillus cereus (B. cereus) در شیر پاستوریزه

خلاصه ی مطلب

اسپور  B. cereus به صورت گسترده در طبیعت پراکنده است، و می توان آن را از مواد غذایی گوناگونی جدا نمود. این باکتری تولید کننده آنتروتوکسین های مولد اسهال و تهوع بوده و قادر به ایجاد سندرم اسهال و تهوع می باشد. لذا بررسی وجود آن در شیر پاستوریزه و احتمال بیماری زایی آن از اهمیت بسزایی برخوردار است. هدف از این مطالعه ردیابی  B. cereus در مراحل مختلف تولید شیر پاستوریزه و میزان افزایش آن می باشد. هم چنین بتوانیم ارتباط بین میزان افزایش این ارگانیسم با سایر میکروارگانیسم های شیر از جمله  ،Coliform بار کلی میکروبی و اسپورهای هوازی را مشخص نماییم. در این تحقیق در طی دو ماه اردیبهشت و خرداد از مراحل گوناگون خط تولید شیر پاستوریزه نمونه گیری، و آزمونهای میکروبی مربوطه بلافاصله انجام شد و داده ها با استفاده از روش آماری   kruskal wals در سطح احتمال  ۱درصد مورد بررسی قرار گرفت و مشخص گردید:

اولاً تعداد  B. cereus در زمان نگهداری شیر پاستوریزه افزایش یافته و هم چنین اختلاف معنی دار نیز نشان داده شد.

ثانیاً معلوم شد تعداد  Coliform در اثر فرایند پاستوریزاسیون کم شده و اختلاف معنی دار نمایان گردید.

ثالثاً تعداد اسپورهای هوازی در شیر خام و شیر پاستوریزه اختلاف معنی دار در سطح احتمال  ۱درصد وجود نداشته است.

احتمال می رود کاهش بار میکروبی شیر عامل موثری در ایجاد شرایط مناسب برای تکثیر  B. cereus باشد.

مقدمه

کیفیت شیر خام بر کیفیت شیر پاستوریزه تأثیر بسزایی دارد. شیر خام با کیفیت بالا برای تهیه شیر پاستوریزه با ماندگاری طولانی ضروری است. افزایش تعداد کل باکتریها در شیر خام نمی تواند تنها عامل تعیین کننده باشد، بلکه نوع باکتریها نیز در این میان اهمیت بسزایی دارد. شیر خام آلوده به باکتری های سرما دوست و مخصوصاً گونه های مقاوم به حرارت در مقایسه با  Coliform و یا شیر خام با همان تعداد کل باکتری ولی در انواع متفاوت سبب می شود شیر پاستوریزه تولید شده از گروه اول ماندگاری کمتری داشته باشد.

باکتریهای سرما دوست به دلیل اینکه قدرت رشد و فعالیت در دمای پایین را دارند، با دارا بودن این قابلیت در فساد مواد غذایی نگهداری شده در یخچال موثر می باشند. این باکتری ها با تولید آنزیم خارج سلولی گوناگون باعث تغییر ترکیبات مواد غذایی شده و در نهایت منجر به فساد مواد غذایی می شوند.

فعالیت این باکتریها در شیر خام نیز اهمیت ویژه ای دارد، زیرا در مدت زمان دریافت شیر خام تا فرآوری حرارتی شیر خام این دسته باکتریها در سرما دوست به رشد و تکثیر خود ادامه می دهند، و با فعالیت آنزیمی خود کیفیت شیر خام و حتی محصولات تولیدی آن را کاهش داده و گاهی تا حدی پیشرفت می کنند، که محصول غیرقابل مصرف می باشد .

در مطالعه ای در سوئد   B. Polymxsa و .B  cereus عامل فساد  ۷۷ درصد از نمونه های فاسد شده شیر را تشکیل دادند. عوامل دیگر مانند سویه های باسیلوس و باکتری های اسید لاکتیک در ایجاد فساد نقش کمتری دارند.

B. Cereus

در سال ۱۹۹۳ -۱۹۹۸ (۲  تا ۱ درصد ) ، از بیماری های ناشی از مصرف مواد غذایی در اروپا به B. Cereus نسبت داده شده است. در سالهای  ۱۹۹۳تا ۱۹۹۸ در نروژ  ۳۳ درصد و در فرانسه بین سال های  ۱۹۹۸تا  ۴۵ ،۲۰۰۰ درصد بیماری های ناشی از مصرف مواد غذایی به این میکروارگانیسم مربوط بود.

  • cereus گرم مثبت می باشد، اما سلول ها ممکن است در فاز ثابت تغییر گرم دهند، از مشخصات دیگر این ارگانیسم هوازی و بی هوازی اختیاری، کاتالاز مثبت و اسپوردار می باشد. و بر روی نوترینت آگار رشد میکند و با آمینواسید و ویتامین ها غنی سازی می شود.

توانایی سنتز آنزیم خارج سلولی، توکسین و آنتی بیوتیک را دارد برای نمونه پروتئیناز، آمیلاز، فسفولیپاز و همولیزین تولید میکند. می تواند عامل چندین عفونت و بیماری ناشی از غذا باشد. اسپور این باکتری همچنین توانایی چسبیدن به سلول های اپیتیال روده را دارد، پس از آن جوانه می زنند و آنترو توکسین تولید می کنند.

  • cereus دو نوع بیماری ایجاد میکند که توسط دو نوع متابولیت گوناگون ایجاد می شود بیماری اسهال بوسیله یک پروتئین با وزن مولکولی بالا و مسمومیت غذایی بوسیله یک پروتئین مقاوم به حرارت با وزن مولکولی کم حاصل می شود.

منابع مهم  B. cereus

منابع مهم  B. cereus عبارتند از خاک، شیر، گوشت، سبزیجات، غلات، ادویه و میوه ها

به منظور بروز بیماری تعداد  ۱۰۵ تا  ۱۰۸ واحد تشکیل دهنده کلنی در هر میلیلیتر یا گرم از ماده غذایی لازم است. نکته مهم آن که در  pH اسیدی معده سلول های رویشی و اسپورهای آن باقی می مانند.

با توجه به اینکه این ارگانیسم عامل ایجاد فساد و مسمومیت مواد غذایی از جمله شیر و فرآورده های آن می باشد و موجب خسارات اقتصادی به تولیدکنندگان و مصرف کنندگان می شود بنابراین با توجه به بار میکروبی بالای شیر در ایران، این مطالعه با هدف اندازه گیری بار کلی میکروبی ۱و کلی فرم در مقایسه با  B. cereus و ردیابی این باکتری در مراحل مختلف تولید شیر پاستوریزه صورت گرفت.

مواد و روش ها

در این تحقیق کلیه محیط کشت های میکروبی از شرکت مرک آلمان خریداری گردید. نمونه ها در دو ماه اردیبهشت و خرداد از شرکت شیر سحر (شیر روزانه) واقع در استان قزوین تهیه گردید.

از مراحل تولید شیر پاستوریزه شامل شیر خام، بالانس تانک، خروجی سپراتور، خروجی پاستوریزاتور، تانک ذخیره شیرپاستوریزه نمونه برداری شد. نمونه ها در اسرع وقت و بر اساس استاندارد جهت آزمون های میکروبی به آزمایشگاه منتقل گردید.

در این مطالعه سعی شده است که با توجه به معیارهای میکروبی بتوان به کیفیت میکروبی شیر پاستوریزه رسید، و رابطه بین میزان آلودگی شیر یعنی بارکلی میکروبی، اسپورهای هوازی، کلی فرم با میکروارگانیسم  B. cereus را مشخص کرد.

شمارش کلی باکتریهای مزوفیل بر اساس استاندارد به روش پورپلیت با استفاده از محیط کشت پلیت کانت آگار انجام شد. سپس نمونه ها در ۳۲ ±۱ درجه سانتیگراد به مدت  ۴۸ ± ۳ساعت نگهداری شده و پس از آن کلنی های ظاهر شده بر محیط کشت شمارش شدند.

به منظور تعیین تعداد کلی فرمها از استاندارد استفاده شد، و محیط کشت ویولت رد بایل آگار مورد استفاده قرار گرفت . پلیت های کشت داده شده در دمای  ۳۶±۱ درجه سانتیگراد به مدت  ۲۴ ساعت نگهداری شدند. پس از مدت زمان ذکر شده کلی فرم ها شمارش گردیدند.

جهت شمارش اسپورهای هوازی بر اساس استاندارد به روش پورپلیت با استفاده از محیط کشت پلیت کانت آگار انجام شد. سپس نمونه ها در ۳۲ ±۱ درجه سانتیگراد به مدت  ۴۸ ± ۳ساعت نگهداری شدند و تعداد کلنی های ظاهر شده بر محیط کشت شمارش شدند .

شمارش  B. cereus

شمارش  B. cereus بر اساس استاندارد به روش کشت سطحی با استفاده از محیط کشت اختصاصی (MYP ) انجام شد. نمونه ها در  ۳۰±۱درجه سانتیگراد به مدت  ۲۴ساعت نگهداری شدند. پس از آن کلنی های ظاهر شده بر محیط کشت شمارش شدند.

در مورد شیر خام در آغاز، شیر به مدت  ۱۰ دقیقه در دمای   ۸۰درجه سلیسیوس حرارت داده شد. در نتیجه این عمل باکتری های مزاحم از بین رفتند و از آن جا که  B. cereus اسپوردار می باشد در محیط باقی ماند.

جدا کردن   B. cereus

برای جدا کردن   B. cereus از شیر پاستوریزه در رقت  ۰/۱ به صورت کشت سطحی در محیط اختصاصی کشت داده شدند.

ابتدا در  ۶۰ روز متوالی، تعداد  ۶۰ نمونه شیر به صورت مجزاء و در هر بار شروع استریلیزاسیون از مخازن ورودی شیر به دست می آید. همچنین پس از اتمام مراحل استریلیزاسیون نیز مجدداً از شیر استریل شده در مخازن خروجی نمونه گیری می شود. در مرحله بعد، پس از شمارش میکرورگانیسم های مورد مطالعه تفاوت معنیدار بین میانگین  ۶۰ نمونه شیر قبل و بعد از استریلیزاسیون جهت تجزیه و تحلیل داده ها از طریق آزمون غیر پارامتری   kruskal wallis مورد استفاده قرار گرفت. و معنیدار بودن در سطح احتمال  ۱درصد بررسی شد.

نتایج

نتایج شمارش میکروبی در نمونه های شیرخام و شیرپاستوریزه نشان داد که در دو ماه اردیبهشت و خرداد بار کلی میکروبی موجود در شیرخام و پاستوریزه اختلاف معنی داری وجود دارد.

بار کلی میکروبی موجود در شیرخام ماه های مذکور تفاوت معنی دار دارد . تجزیه و تحلیل آماری داده ها نشان داد که در دو ماه خرداد و اردیبهشت تعداد کلی فرم موجود در شیر خام و پاستوریزه اختلاف معنی داری وجود دارد.

که می تواند تأثیر فرآیند پاستوریزاسیون را در از بین رفتن این میکروارگانیسم نشان دهد تعداد کلی فرم موجود در شیر خام خرداد و اردیبهشت تفاوت معنیداری دارد.

با توجه به بررسی های انجام شده و شمارش تعداد اسپورهای هوازی مشخص گردید، داده ها در طی دو ماه اردیبهشت و خرداد اختلاف معنیدار ندارند.

در حالی که در ماه های مذکور بین تعداد اسپورهای موجود در شیرخام و شیر استریل تفاوت معنیداری وجود دارد. هم چنین در دو ماه اردیبهشت و خرداد تعداد اسپور شیر پاستوریزه در مقایسه با تعداد اسپور شیر استریل تفاوت معنیداری را نشان داد.

تعداد اسپورهای شیرخام و شیر پاستوریزه در طی دو ماه اختلاف معنیداری وجود ندارد.

نتایج نشان داد که شیر خام دارای B. cereus می باشد و در هر میلیلیتر شیر  ۱۰تا  ۲۰کلنی مشخص گردید.کلنی های بزرگ صورتی با هاله رسوبدار را به عنوان  B. cereus احتمالی شمارش می کنیم.

تجزیه و تحلیل آماری داده های حاصل از شمارش .B  cereus شیر خام با تانک ذخیره شیر پاستوریزه در دو ماه اردیبهشت و خرداد اختلاف معنیداری را نشان داد.

تعداد  B. cereus شیر خام خرداد ماه با شیر خروجی سپراتور و پاستوریزاتور اردیبهشت ماه اختلاف معنیدار نشان می دهد .

در حالی که .B  cereus شیر خام دو ماه اختلاف معنی دار ندارد. تعداد  B. cereus شیر خروجی سپراتور دو ماه مذکور با شیر تانک ذخیره اختلاف معنیداری دارد. که نشان دهنده افزایش تعداد این میکروارگانیسم در طی مسیر پاستوریزاسیون می باشد.

بحث

نتایج شمارش میکروبی در نمونه های شیرخام و شیرپاستوریزه نشان داد که در دو ماه اردیبهشت و خرداد بار کلی میکروبی شیر پاستوریزه کاهش یافت، می تواند تأثیر فرایند پاستوریزاسیون را در کاهش بار کلی میکروبی نشان دهد. بار کلی میکروبی موجود در شیرخام خرداد ماه نسبت به اردیبهشت ماه افزایش را مشخص کرد، می تواند نشان دهنده شرایط بهداشتی نامساعدتر خرداد ماه نسبت به اردیبهشت ماه باشد.

احتمالاً به علت تأثیر بالا رفتن درجه حرارت هوا در خرداد ماه نسبت به اردیبهشت ماه است. در تمام نمونه های شیر پاستوریزه مورد آزمون تعداد کلی فرم  ها پس از پاستوریزاسیون به صفر رسید،

چند مورد کلی فرم در شیر پاستوریزه مشاهده گردید، که احتمالاً عوامل موثر در این مشاهده شامل ناکافی بودن فرایند حرارتی، آلودگی ثانویه، شستشوی ناکافی تانک های ذخیره و غلظت نامناسب سود و اسید باشند. کلی فرم ها به عنوان شاخص رعایت بهداشت در طی فرایند و پس از پاستوریزاسیون به شمار می آیند.

این میکروارگانیسم ها از طریق نوک پستان، سطوح خارجی پستان، تجهیزات حمل و نقل و شیر دوشی، تانک های حمل شیر به شیر خام منتقل می شوند. در اثر فرایند پاستوریزاسیون غیر فعال می شوند، بنابراین حضور آنها در شیر پاستوریزه شاخصی از آلودگی پس از فرایند و عدم رعایت موازین بهداشتی است.

تعداد اسپورهای هوازی بعد فرایند پاستوریزاسیون تغییری در آن مشاهده نشد. این نشان می دهد احتمالاً فرایند پاستوریزاسیون بر روی تعداد اسپورهای هوازی تأثیر چندانی نداشته است. تعدا اسپورهای هوازی بعد فرایند استریل کاهش یافت و در مواردی به صفر رسید، می تواند نشان دهنده تأثیر فرایند استریل بر اسپورها باشد.
چند موردی هم که اسپور در شیر استریل مشاهده شد برروی محیط کشت اختصاصی باسیلوس ثکثیر نشد و در رنگ آمیزی گرم وجود نوعی کوکسی مشخص گردید.
نتایج افزایش B. cereus را در طی فرایند پاستوریزاسیون شیر نشان داد احتمالاً علت افزایش .B  cereus در تانک ذخیره شیر پاستوریزه از بین رفتن و کاهش بار میکروبی شیر پاستوریزه می باشد. به علت از بین رفتن محیط رقابتی B. cereusدر این شرایط مناسب ایجاد شده تکثیر می یابد. فرایند پاستوریزاسیون تعداد کل میکروارگانیسم های شیر خام را  ۹۰تا ۹۹ درصد کاهش می دهد.

شیر پاستوریزه به علت فعالیت آبی مناسب،  pHنزدیک خنثی، حضور ترکیبات نیتروژن دار و منابع کربنی در دسترس و عوامل رشد گوناگون وکاهش بار میکروبی محیطی مناسب جهت رشد B. cereusفراهم میکند.

رشد تدریجی
میکروارگانیسم B. cereus و تغییرات متابولیکی ناشی از فعالیت آن در شیر پاستوریزه نگهداری شده در یخچال سبب فساد آن می گردد. این نتایج با نتایج ارئه شده توسط محققان مطابقت دارد. می توان احتمال داد این مقدار افزایش تعداد B. cereus در طی مسیر پاستوریزاسیون نشان دهنده لانه گزینی و تکثیر .B cereus باشد، این نتایج با نتایج ارائه شده توسط محققان مطابقت دارد.
هم چنین نتایج کشت آب حاصل از شستشوی خطوط تولید و تجهیزات وجود B. cereus را نشان می دهد. می تواند بیانگر این موضوع باشد که فرآیند شستشوی معمول خطوط با سود و اسید B. cereus را از بین نبرده است . B. cereus احتمالاً در خطوط لوله و تجهیزات خط تولید خصوصاً گوشه ها، زانوها، فیلترها و نقاط کور باقی مانده، تکثیر می یابد و سبب افزایش تعداد B. cereus در شیر پاستوریزه می شود.

 

اشتراک در تلگرام
Cresta Help Chat
Send via WhatsApp