جداسازي و شناسایی فلور لاکتیکی پنیر لیقوان

تاثیر فلـورلاکتیکی بـر خـواص حـسی و فیزیکـی پنیرهـاي حاصل از شیر خام مختلف مـورد مطالعـه وسـیع در سـطح جهان قرار گرفته است. هدف از اینگونه تحقیقـات، بررسـی پتانسیل و توانایی صنعتی کردن این محصولات سنتی است. تحقیق و بررسی در مورد باکتري هاي اسید لاکتیک پنیرهاي حاصل از شیر خام ایران به ندرت صورت گرفته است. باکتری هاي اسید لاکتیک که به عنوان کشت آغازگر )استارتر( به شیر اضافه می شوند یا به صورت ذاتی و طبیعی در شیر وجـود دارنـد، نقـش مهمـی را در طعـم وعطـر پنیـر بـازي می کنند. از سوي دیگر، برخی باکتری هاي اسید لاکتیک مانند انتروکوکوس ها، به دلیل تولیـد باکتریوسـین، مـی تواننـد از رشد باکتریهاي پاتوژن ممانعت به عمل آورند. به همین دلیل این باکتریها از دیدگاه تکنولـوژیکی، حـائز اهمیـت هـستند. در این مقاله به بررسی جداسازي و شناسایی فلور لاکتیکی پنیر لیقوان از تولید تا رسیدن می‌پردازیم.

آنچه در این مطلب می‌خوانید:

برخی از باکتریهاي لاکتیک خاص، از قبیـل: لاکتوباسـیلوس پاراکــازئی زیــر گونــه پاراکــازئی، انتروکوکــوس فکــالیس، انتروکوکـــوس فاســـیوم، لاکتوباســـیلوس کورواتـــوس، لاکتوکوکــوس لاکتــیس زیرگونــه لاکتــیس توانــایی تولیــد باکتریوسین را دارند.

کاربرد کشت هاي آغازگر

ازنظر صنعتی، کاربرد کشت هاي آغازگر ویژه باعـث ایجـاد کیفیت ثابت در محـصول مـی گـردد ولـی منجـر بـه تو محصولی بـا محـدودیت طعـم مـی شـود. از سـوي دیگـر، مصرف کنندگان، فرآورده هاي لبنی با طعم طبیعی و اصلی را ترجیح می دهند. به همین دلیل، جستجو و کاوش سویه هاي وحشی موجود در طبیعـت و نیـز در محـصولات تخمیـري سنتی، مثل فلور لاکتیکی پنیر لیقوان جهت تولید فرآورده هاي لبنی جدید با طعم اصـیل و طبیعی مورد توجه بسیار می باشد. پنیرهاي حاصـل از شـیر خام که به صورت سنتی تولید می شوند، پتانسیل جداسازي نژادهاي جدید جهت بهره برداري در صنعت لبنیـات را دارا می باشند.

پنیر لیقـوان چیست؟

درمیان چندین پنیر حاصل از شیر خام در ایران، پنیر لیقـوان معروف ترین و مشهورترین پنیر سنتی ایرانی می باشد که از شیر خام گوسفند تولید می شـود. ایـن شـهرت و مقبولیـت مـدیون طعـم وآرومـاي خـاص و مطلـوب ایـن نـوع پنیـر است. این پنیربه عنوان یـک نـوع پنیـر نیمـه نـرم بـا طعـم تـرش مطلوب، رنگ کرم و میزان چربی بالا و بافت ترد طبقه بندي می شود. پنیر لیقوان در یک روستایی به همین نـام در اسـتان آذربایجان شرقی در برخی از پایلوت هـاي کوچـک محلـی تولید می شود. در تولید این پنیر هیچ نوع استارتري استفاده نمی شود وتنها رنین طبیعی افزوده شده وسپس دلمه نهـایی بریده شده و با استفاده از پارچه صافی مخـصوصی آب گیـري شده وپرس می شود. دلمه بدست آمده در داخل آب نمـک %۲۲به مدت ۲۴ساعت و پـس از آن در داخـل آب نمـک %۱۲بـراي دوره رسـیدگی سـه ماهـه قـرار مـی گیـرد.

دوره رسیدگی در داخل غارهاي زیرزمینی کـه بطـورطبیعی داراي دماي سرد می باشند، صورت می گیرد. بـاکتري هـاي اسـید لاکتیک ذاتی موجـود در شـیر، داراي فعالیـت پروتئولیتیـک، لیپولیتیک و گلیکولیتیک در دوره رسـیدن بـوده و ترکیبـات آروماتیک مختلفی را تولید می کنند که طعم و آروماي اصلی را به پنیر می دهد. جستجو وشناسایی استارتر ذاتی و نژادهاي وحـشی، جهـت تولید پنیر لیقوان با طعم مخصوص به خود در مقیاس صنعتی لازم و ضروري می باشد.

روش تحقیق

نمونه برداري در فصل تابستان و از چهار مرحله شیر، دلمه، پنیرتازه (یک روزه) و پنیر رسیده (سه مـاه رسـیدگی) از ده تولید کننـده پنیر لیقـوان از روسـتاي لیقـوان تبریـز صـورت گرفت. سپس نمونه هـا تحـت شـرایط سـردخانه (دمـاي ۴ درجــه ســانتیگراد) بــه آزمایــشگاه میکروبیولــوژي منتقــل گردیدند.

تولید پنیر لیقوان

در فرایند تولید پنیر لیقوان، شیرخام کامل گوسـفند، پـس از جمع آوري و انتقال به کارگاه تولید پنیر، جهت صاف کردن از طریق پارچه هاي صـافی، داخـل ظـروف فلـزي بزرگـی ریخته شده و از شیر نمونه برداري گردید. سپس دماي شـیر بوسیله قرار دادن بشکه هاي آب سرد داخل ظـروف بـزرگ حاوي شیر، به حدود ۲۵درجه سانتیگراد کاهش داده شد و در این دما به شیر آنزیم رنین تجاري )میتو (MEITOیا رنـی لسه اضافه گردید.

عمل انعقاد شیر حدود دو ساعت به طول انجامید . عمل نمونه برداري از دلمه در این مرحلـه صـورت گرفت. سپس دلمه حاصل به قطعاتی برش خورده و توسـط پارچه هایی پوشیده شـده و بخـش اعظـم آب پنیـر در ایـن مرحله حذف گردید. انتهاي پارچه هاي صافی سپس محکم بسته شده وعمل آبگیري از پنیـر بـه مـدت ۵سـاعت طـول کشید وبعد از آن دلمه پرس شـده بـه قطعـات بلـوك ماننـد برش خورده و داخـل آب نمـک ۲۴درصـد بـه مـدت ۲۴ ساعت قرار گرفته وسپس ذرات درشت نمک جامد در سطح آن پاشیده شد و به مدت ۲۴ساعت در همین حالـت بـاقی ماندند و نمونه هاي پنیر تـازه در ایـن مرحلـه جمـع آوري گردیدند. سپس در روز بعد، قالب هاي برش خورده پنیر در داخل حلب هاي با آب نمـک ۱۲-۱۱درصـد قـرار گرفتـه وحلب هاي پنیر به غارهـاي زیرزمینـی بـا درجـه حـرارت طبیعی ) ۱۰-۸درجه سانتیگراد( منتقل شـدند و حـداقل بـه مدت ۳ماه دوره رسیدگی را سپري کردند. در حـین فراینـد تولید این پنیر هیچ اسـتارتري اضـافه نـشد. پنیـر رسـیده در انتهاي دوره رسیدگی جمع آوري شد.

بیشتر بخوانید: تهیه سرشیر خانگی، با نکات طلایی

آماده سازي نمونه هاي شیر، دلمـه و پنیر

جهت نمونه هاي شیر، به طور مـستقیم عمـل رقـت سـازي دهدهی در آب پپتونه % ۱/۰استریل صورت گرفـت و بـراي نمونه هاي دلمه و پنیر تازه و رسیده، ابتدا ۲۵گرم از دلمه یا پنیر به ۲۲۵سی سـی محلـول سـیترات سـدیم %۲وزنـی- حجمی استریل اضافه شد و مجموعه به داخل کیسه استریل مخصوص دسـتگاه اسـتومکر )مـدل ( Seward, UKمنتقـل گردید و داخل دستگاه به مدت ۵ دقیقـه بـا سـرعت نرمـال مخلوط شد، سپس محلول حاصل به عنوان رقت ۱/۰براي تهیه رقت هاي بعدي استفاده شد. براي رقت هاي بعدي ۱۰به توان منفی ۲ تا ۱۰ به توان منفی ۷ از آب پپتونه استریل ۱/۰درصد وزنی- حجمی استفاده گردید. سپس از لوله هاي حاوي رقت هاي تهیه شده به میزان ۱/۰میلی لیتر بوسیله سمپلر )کشت سطحی( روي سـطح محـیط هـاي کـشت MRS-Agarبـراي ایزولاسـیون بـرايMRS Agar+vancomycin (20μg/mL)، لاکتوباسیل ها جداســـازي لویکونوســـتوك هـــا، M17-Agarبـــراي لاکتوکوکوس ها و KAA1براي انتروکوکوس ها منتقل گردید.

هر کشت در دوتکرار انجام شد. لازم به ذکر است براي هر محــیط کــشت از رقــت هــاي مــورد نظــر یــک کــشت آمیخته (Pour plate) نیز صورت گرفت. سپس محـیط هـاي کشت تلقیح شده داخل جاربی هوازي مرك بـه همـراه گـاز پک مدل Aدر سه دماي ۴۵ ، ۳۷ ۳۰و درجه سانتیگراد جهت رشد باکتریهاي مزوفیل وترموفیـل قرارگرفـت. مـدت زمـان گرمخانه گذاري بسته به نوع باکتري بین ۲۴تـا ۴۸سـاعت وحداکثر ۷۲ساعت در نظرگرفته شد.

پس از سپري شدن مدت گرمخانه گذاري و خروج پلیت ها از داخل جار بی هوازي، ابتدا پلیت هاي حاوي ۲۵تـا ۳۰۰ کلونی را شمارش کرده وسپس از پلیت هاي داراي بالاترین رقت، ۵ ۴تا کلونی که از نظر شکل، رنگ و اندازه متفـاوت بودند، برداشته شد و تجه خالص سازي بیشتر ۳ ۲تا بار بر روي همان محیط هاي کشت قبلی، کشت خطی مجـدد داده شد.

سپس کلونی هاي خالص بدسـت آمـده درهـر پلیـت مـورد آزمونهاي رنگ آمیزي گرم، تست کاتـالاز و مورفولـوژي در زیر میکروسکوپ قرار گرفتند. در نهایت، فقط جدایه هـاي گرم مثبت و کاتالاز منفی جداسـازي شـده و داخـل محـیط MRS brothحاوي %۲۰گلیسرول نگهداري و بـه صـورت انجمادي خـشک شـدند. در مجمـوع حـدود ۹۵جدایـه از مجموع نمونه ها (شیر، دلمه، پنیر تازه و پنیـر رسـیده) جـدا گردید و مورد آزمون هاي بیوشیمیایی و تست هاي تائیـدي قرار گرفتند.

آزمون هاي بیوشـیمیایی و تـست هـاي تاییدي

ابتدا بر روي هر کلونی خالص بدسـت آمـده، آزمـون رنـگ آمیزي گرم وتست کاتالاز صورت گرفت. پس از اطمینان از گرم مثبت وکاتالاز منفی بودن کلونی یا جدایـه مـورد نظـر، خصوصیات مورفولوژي سلولی در زیر میکروسکوپ بررسی شد و باسیل یا کوکسی بودن آن تایید گردید. تست رشد دردماي ۴۵ ۱۰و درجه سانتیگراد، رشد در غلظت نمک %، ۵/۶ رشد در ،pH= 6/9 تست هیدرولیز آرژنین به کمـک معـرف نسلر، هیدرولیز اسکولین، تولید گاز دي اکسید کربن از قن گلوکزدر MRS brothدر لوله دورهام جهت تشخیص همـو یا هتروفرمانتاتیو بودن، تجزیـه سـیترات در محـیط سـیمون سیترات آگار و آزمون وگوس- پروسـکوئر در محـیط –MR VPبه عنوان تست هاي تائیدي صورت گرفتند.

در نهایت، جدایه هاي کوکسی گـرم مثبـت، کاتـالاز منفـی، هموفرمنتاتیو قادر به رشد در دماي ۱۰درجه سانتیگراد ولی عدم توانایی رشد در دمـاي ۴۵درجـه سـانتیگراد و غلظـت نمک % ۵/۶به عنـوان جـنس لاکتوکوکـوس در نظـر گرفتـه شدند. آزمون هیدرولیز آرژنین و تولید استوئین در تست VP و تخمیر کربوهیدراتها بـه عنـوان آزمون هـاي تاییـدي بیـشتر وشناسایی تا مرحله گونه وزیر گونه صورت گرفت. جهـت شناسایی و گروه بندي تا سطح گونه از کیت هـاي API 50 ) CHبیومریکس فرانسه) استفاده شد.

کوکسی هاي گرم مثبت، کاتالاز منفی، هموفرمانتاتیو قادر به رشد در دماي ۱۰و ۴۵درجه سانتیگراد و نیز قادر به رشد درغلظـــت ۶/۹ % ۵/۶نمـــک و = pHبـــه عنـــوان جـــنس انتروکوکوس در نظرگرفته شدند. جهت شناسایی تا حد گونه تست (API 20 STREPبیومریکس فرانسه) صورت گرفت.

کوکسی هاي گرم مثبت، کاتالاز منفی هموفرمنتاتیو با آرایش سلولی تتراد به عنوان پدیوکوکوس وکوکسی هاي گرم مثبت ،کاتالاز منفی هتروفرمنتاتیو کـه قـادر بـه هیـدرولیز آرژنـین نبودند، به عنوان لویکونستوك در نظر گرفته شدند.

جهت باکتري هاي میله اي شکل گرم مثبت و کاتـالازمنفی، رشد در دماي ۱۵و ۴۵درجه سـانتیگراد و نیـز تولیـد گـاز CO2از گلوکز در لوله دورهام صورت گرفت. در پایان،پس از شناسایی جدایه ها در سطح جنس با استفاده از تـست هـاي بیوشـیمیایی وتاییـدي، آزمـون تخمیـر قنـد وکربوهیدراتها با استفاده از دسـتورالعمل APIوکیـت هـاي تخمیر قند به صورت ذیـل صـورت پـذیرفت. بـه طوریکـه جهت جدایـه هـاي تائیـد شـده بـه عنـوان لاکتوباسـیلوس، لاکتوکوکوس، پدیوکوکوس و لویکونستوك از کیت و روش API 50 CHوجهـت جدایـه هـاي تائیـد شـده بـه عنـوان انتروکوکــوس از کیــت و روش API 20 STREPاســتفاده گردید. از کیت مطابق دستور العمل شرکت سازنده اسـتفاده گردید.

آنالیز آماري

پروفایل هاي بدسـت آمـده توسـط کیـت هـاي API 50 CH Simple matching با کمـک بـا ضـریب API 20 STREP و coefficientبـا هـم مقایـسه شـدند و بـا اسـتفاده از آنـالیز Multi-variate – Statistical Package از برنامه UPGMA2 programخوشه بندي شدند.

بیشتر بخوانید: سیب سلامت چیست؟ پل اعتماد بین تولیدکننده و مصرف‌کننده

داده هاي حاصل از log cfu/gدر نرم افـزاز Minitab مـورد آنالیز واریانس قرار گرفته و میانگین هـاي حاصـل از آن در نرم افزاز MSTATC مورد مقایسه میـانگین بـا آزمـون LSD قرار گرفتـه و سـطوح معنـی داري آن بـا حـروف ,…a,b,cمشخص شدند.

نتایج وبحث

ایزولاسیون و شناسایی باکتري هـاي اسـید لاکتیـک از پنیـر لیقوان در چهار مرحله مختلف شیر، دلمه، پنیر تازه یک روزه و پنیر رسیده (سه ماه دوره رسـیدگی) بـا اسـتفاده از تـست هاي تکمیلی و تائیدي تا مرحله جنس و سپس باکمک کیت هاي APIتا مرحله گونه صورت گرفت. توزیع باکتري هاي اسید لاکتیک جدا شده از محـیط کـشت هاي مختلف براي پنیر لیقوان در چهار مرحله به دست آمد. این اطلاعات در مورد انتخاب پذیري و مناسب بودن محیط کشت هاي مختلف براي باکتري هاي لاکتیک ارائه می کند.

محــیط MRS agarبــراي بــاکتري هــاي جــنس لاکتوباسیلوس مناسب بوده است و این جنس به طـور قابـل ملاحظه اي در ایـن محـیط غالـب بـود ( ۲۲جدایـه). گورسس و همکاران ( ۲۰۰۸ ) نتـایج مـشابهی را براي پنیر تولوم نشان دادند. از سوي دیگر، سایر جـنس ها از قبیل لاکتوکوکوس (۳جدایـه از ۳۳) انتروکوکـوس (۴ جدایـه از ۳۳) و پـــدیوکوکوس (۳جدایــه از ۳۳) و نیـــز لویکونستوك (۱جدایه از ۳۳) در ایـن محـیط کـشت پیـدا شدند.

لوپز – دیاز وهمکاران (۲۰۰۰) ۳نیز گزارش کردند که تعداد باکتري هاي جنس لاکتوباسیلوس و لاکتوکوکـوس در این محیط بیش از سایر جنس هـا مـی باشـد، کـه ایـن امـر مناسب بودن محیط MRSرا براي جداسازي گونه هاي ایـن جنس تائید می کند. بیش از نیمی از جدایه ها بر روي محیط ۲۲( MRSجدایه از ۳۳) لاکتوباسیلوس بودند، و بقیه باکتري ها کوکـسی شـکل بودند.محیط MRSبه دلیل میزان انتخاب پذیري پـایین ایـن محیط، اجازه رشـد جـنس هـاي مختلـف از اسـید لاکتیـک باکتري هاي کوکسی شکل را هم می دهد.

در مطالعه ما، اکثر نژادهاي جدا شده از این محیط کشت، لاکتوکوکسی بودند ) ۱۸جدایه از .( ۳۰در مقابل، نوید قاسمی زاد و همکاران (۲۰۰۹) ۵نشان دادند کـه اکثــر جدایـه هـاي جداشـده از محـیط M17 انتروکوکـوس بودند.

تقریبا تمـام ۳۰جدایـه جداشـده از محـیط M17 اسـیدلاکتیک باکتریهـاي کوکـسی شـکل بودنـد کـه شـامل لاکتوکوکوس (۱۸جدایه از ۳۰) انتروکوکوس (۱۰جدایـه از ۳۰) و پدیوکوکوس (۱جدایه از ۳۰) بودند. تنها یک جدایه باقی مانده متعلق به جنس لاکتوباسـیلوس بـود (۱جدایـه از ۳۰) کارایی و مفید بودن این محیط توسط سایر محققان نیز به اثبات رسیده است.

محــیط KAA انتخــاب پــذیري بــالایی را بــراي جــنس انتروکوکــوس نــشان داد (۱۸جدایــه از ۲۲) گورســس و اردوگان (۲۰۰۶) اکثر باکتري هاي جـنس انتروکوکـوس را از محیط کشت PCA agar جداکردند.

محیط MRSغنی شده با آنتی بیوتیک ونکومایسین، به دلیل مقاومت بالاي جنس لویکونستوك در برابر این آنتی بیوتیک، یک محیط مناسب و انتخابی براي این جنس بـه شـمار مـی رود. هرچند که، سایر باکتری هاي اسید لاکتیک مانند بـسیاري از گونه هاي جنس لاکتوباسیلوس توانایی رشد بر روي ایـن محیط را دارند.

رونـد تغییـرات بـــاکتري هـــا بـــر حـــسب ( Log cfu/ml(gr در محـــیط کشت هاي مختلف مورد استفاده جهت اسیدلاکتیک بـاکتري ها در سه دماي ۴۵ ، ۳۷ ۳۰و درجه سانتیگراد از مرحله شیر تا پنیر لیقوان رسیده (در طول مراحل مختلـف تولیـد) ارائـه شده است. در محیط ،MRSتعداد کلونی ها از مرحله تولید شیر تا مرحله دلمه افزایش (بدون تفاوت آماري معنی دار) در سطح %۵و پس از آن تا مرحله پنیر رسـیده کـاهش معنـی داري داشــــته اســــت. در محــــیط کــــشت ، MRS +vancomycin هیچ روند افزایـشی یـا کاهـشی ثابـت ویکنواختی مشاهده نشد. در محیط کشت ، M17 یک رونـد افزایشی از شیر تا دلمه فقط در دمـاي ۳۷درجـه سـانتیگراد مــشاهده شـد کــه ایــن تفــاوت از نظــر آمــاري معنــی دار نبود.

در محیط کشت ،KAA در دمـاي ۴۵درجـه سانتیگراد، روند افزایشی ولـی بـدون تفـاوت آمـاري معنـی دار از شیر تا پنیر تازه و بعـد از آن کـاهش معنـی داري تــا مرحلــه پنیــر رســیده مــشاهده شــد.

خصوصیات بیوشیمیایی باکتري هـاي اسـیدلاکتیک ایزوله شده از مراحل مختلف تولید پنیر لیقوان از شیر تا پنیر رسیده به دست آمد. در میان لاکتوباسیل هـا، فقـط یـک گونه در دماي بالا و غلظت نمک % ۵/۶رشد نشان داد. تمام لاکتوباسیل ها رشد در pH 9.6و عدم رشد در محیط VPرا نشان دادند. تنهـا لاکتوباسـیلوس هتروفرمنتـاتیو، Lb.brevis بود.

در میان کوکسی ها، تنها باکتري هـاي جـنس انتروکوکـوس رشد در دماي بالا و در pH 9.6نشان دادند. تمام کوکسی ها در دماي ۱۵درجه سـانتیگراد رشـد داشـتند. لاکتوکوکـوس لاکتیس زیرگونه لاکتیس و لویکونستوك لاکتیس در غلظـت بالاي نمک % ۵/۶رشد نداشـتند. دو گونـه هتروفرمنتـاتیو از بودند.Leu.lactis, Leu.mesenteroides, جنس لویکونستوك تمام کوکسی ها به اسـتثناي Leu.mesenteroidesدر محـیط VPرشــد داشــتند. هیــدرولیز آرژنــین بــراي Leu.lactis منفی بود Leu.mesenteroides و به منظور درك نقش و اهمیت هـر یـک از ایـن گونـه هـاي لاکتیکی، ابتدا تغییرات آنهـا در طـی رسـیدگی و در مراحـل مختلف بررسی شد.

بیشتر بخوانید: چرا پنیر پیتزا مضر است؟ 10 دلیل به همراه راهکار‌‌های موثر

در مرحلـه شـیر، جنس انتروکوکوس غالب بود (تعداد سویه هاي جداشده) و بعــد از آن بــه ترتیــب جــنس هــاي لاکتوباســیلوس و لاکتوکوکوس و با درصد اندکی جنس پدیوکوکوس جمعیت اصلی شیر را تشکیل می دادند.

دردوره رسیدگی در مراحـل بعدي، انتروکوکوس ها و به میزان کمتري لاکتوباسیلوس ها، روند افزایشی نشان دادند، اما لاکتوکوکـوس هـا بـه تـدریج کاهش یافتند. این پدیده و ویژگی منطقی به نظر مـی رسـد، چرا که در اکثرانواع پنیرها، روند مشابهی مشاهده شده است.

در اولـین مرحلـه فــراوري، لاکتوکوکـسی هــا کـه مــسئول اسیدیفیکاسیون شیر هستند، طیـف غالـب فلـور لاکتیکـی را تشکیل می دهند و تا مرحله تشکیل دلمه پیشرفت می کنند.

در مراحـل بعــدي، ســایر بــاکتري هــاي لاکتیکــی از قبیــل انتروکوکوس ها و لاکتوباسیلوس ها غالب می شوند در پنیر لیقوان رسیده درصد بـالایی از بـاکتري هـاي جـنس انتروکوکوس پیدا شد. به دلیل حضور پیوسـته بـاکتري هـاي ایــن جــنس در انــواع مختلــف پنیرهــا، تــاثیر ونقــش انتروکوکـوس هـا در تولیـد پنیـر مـورد بررسـی و مطالعـه قرارگرفته است.برخی نظرات و عقیـده هـاي متنـا قـض درمورد این گروه از باکتري هاي اسیدلاکتیک مطرح می باشد . راEnt. faecalis var. liqefaciensبرخی محققان، اثـر مثبـت در کیفیت پنیر راکوفورت به اثبـات رسـانده انـد، )دویـود (۱۹۶۹ودویــــود و مــــولر ۱۹۶۹( ) و دویــــود و دسمازید (۱۹۷۱ ) تاثیر مفید انتروکوکوس هـا را بررشـدنـد.

سایر باکتري هاي اسیدلاکتیک پیـدا کرد . ازسـوي دیگـر، تولید باکتریوسین )انتروسین( توسط انتروکوکوس هـا، روي باکتري هاي پاتوژن در پنیر و نیز بـاکتري هـاي مولـد آمـین هاي بیوژنیک مانند برخی لاکتوباسیل ها، اثر کنترل کننـدگی دارد ) . گیرافا ،۱۹۹۵ ۴آیمریچ و همکاران ،۱۹۹۶ ۵فاریـاس و همکاران ،۱۹۹۴ ۶جوستن و نونز .[ ۹-۱۲ ] ۱۹۹۶( ۷در مقابل، برخی اثرات منفی برسلامت و کیفیت پنیر براي انتروکوکوس ها گزارش شده است. سالوادوري ، ۱۹۶۹( ) ۸توسعه طعم تلخ را به دلیل کاربرد انتروکوکوس فکالیس به عنوان اسـتارتر در تولید پنیر گورگونزولا، متوجه شد.

جنس لاکتوباسـیلوس شـامل (% ۶۸/۳۳) لاکتوباسـیلوس پلانتـاروم ( % ۰/۲۰) فـراوان تـرین گونــه لاکتوباســیل، بعــد از آن بــه ترتیــب لاکتوباســیلوس پاراکـازئی زیـر گونـه پاراکـازئی ( % ۳۶/۷ل) اکتوباسـیلوس برویس ) ،(% ۱۵/۳)لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه دلبروکـی (% ۱۰/۲) و لاکتوباسیلوس فروکتی ورانس ) (% ۰۵/۱) در کـل مراحل تولید بود. به طور کلی ، جنس لاکتوباسـیلوس داراي یک روند افزایشی از شیر) (% ۰۸/۲۶به دلمـه ) (% ۴۷/۴۳) بـود وپـس از آن یـک سـیر نزولـی را تـا مرحلـه پنیـر رســیده ) (% ۲۳/۱۹) نشان داد.

لاکتوباسیلوس پلانتاروم تنها گونه اي از جنس لاکتوباسیلوس بود که در تمـام مراحـل تولیـد یافـت شد. لاکتوباسیلوس برویس، تغییر قابـل مـلا حظـه اي را در طی دوره رسیدگی نشان نداد. در این خصوص گورسـس و اردوگان نتایج مشابهی را درمورد لاکتوباسـیلوس بـرویس و لاکتوباسیلوس کورواتوس در تحقیق شـان نـشان دادنـد.

بـاکتري هـاي لویکونـستوك مزنترویـدیس و لویکونـستوك لاکتـیس بـه ترتیـب در دلمـه و پنیـر رسـیده پیـدا شــدند. لاکتوکوکــوس لاکتــیس زیرگونــه لاکتــیس تقریبــا % ۰۸/۲۶ ازباکتري هاي لاکتیکی را درنمونه هاي شیر و دلمه تـشکیل می داد و پس از آن تا مرحله پنیر رسیده کاهش یافت. روند مشابهی توسط گورسس و اردوگان در پنیر تولـوم مـشاهده گردید.

پدیوکوکوس پنتوزاسئوس، تنها در مراحل شیر و پنیر تازه یافت شدند. در نهایـت، تعـداد متنـابهی از بـاکتري هاي جنس انتروکوکوس در نمونه هاي ما مـشهود بـود، بـه نـه خصوص دو گو انتروکوکـوس فکـالیس و انتروکوکـوس فاسیوم، گونه هاي غا لب) (% ۷۸/۱۵را در کل مراحل تولید از ابتـــدا )شـــیر( تـــا انتهـــا )پنیـــر رســـیده( تـــشکیل می دادند.

انتروکوکوس فکالیس یک گونه متداول اسـت کـه به صورت مکرر ومتناوب از انواع مختلف پنیر مانند پنیر آبی ایزوله شده است. این جنس، در پنیرهاي سنتی مختلـف مانند پنیر فتا، مانچگو ،تلم ،کومتـه ،فونتینـا ،سـررا و ســبریرو )ســنتنو وهمکــاران، ۱۹۹۹ ســارانتینوپولوس وهمکاران ،۲۰۰۲ گیرافا ،۲۰۰۳مارینو و همکاران.

نتیجه گیري

در میان گونه هـاي اسـیدلاکتیک بـاکتري هـاي پیدا شـده در نمونه هـاي مـا، کـه متعلـق بـه جـنس هـاي انتروکوکـوس، لاکتوباســیلوس و لاکتوکوکــوس بودنــد، جمعیــت اصــلی لاکتیکی در حین مراحل تولیـد پنیـر لیقـوان را تـشکیل مـی دهند. انتروکوکوس ها، به ویژه در پنیر رسیده فلور غالب بودند. انتروکوکوس ها روند افزایشی ولاکتوکوکوس ها روند نزولی را در انتهاي رسیدن نشان دادنـد. گونـه هـاي لاکتوکوکـوس لاکتـــیس زیرگونـــه لاکتـــیس، انتروکوکـــوس فکـــالیس، انتروکوکوس فاسیوم ولاکتوباسـیلوس پلانتـاروم نـسبت بـه سایر گونه ها، از مراحل مختلـف تولیـد در تعـداد بـالاتري شناسایی شدند. این حقیقت بر این امر دلالت می کند که این گونه هـا فلور لاکتیکی پنیر لیقوان نقـش مهمـی را در تولیـد و رسـیدگی پنیـر بـازي می کنند. به منظور کـاربرد ایـن نژادهـا در مقیـاس صـنعتی، توجه بیشتري باید معطوف به شناسایی دقیق تر این گونه ها در سطح زیرگونه گردد. جهت دستیابی به این هدف، تکنیک هاي دقیق تري مانند روش هاي مولکولی مورد نیاز است.