تولید اگزوپلی ساکارید از ماست و پنیر

امروزه تولید فراورده های پروبیوتیک با منشاء لبنی و غیر لبنی گسترش یافته است. کشت های آغازگر لاکتوباسیل به طور گسترده در تولید محصولات تخمیری شیر، گوشت و سبزیجات بکار می روند. در تمام دنیا محصولات بسیار متنوع از نظر طعم، عطر، بافت و خصوصیات سلامت بخش با استفاده از تکنیک ها، کشت های آغازگر  (Starter Culture) و کشت های آغازگر همراه  (Co-culture ) تولید می شوند. محصولات لبنی تولیدی به روش صنعتی طعم محصولات سنتی را ندارند یا برخی از ویژگی های حسی آنها بسیار ضعیف است که این امر با پاستوریزاسیون شیر و استفاده از استارترهای تجاری مشخص در ساخت محصولات لبنی صنعتی مرتبط است. محصولات لبنی سنتی، پروفیل های طعمی گسترده تر و محسوس تری را نشان می دهند. خصوصیات ویژه این محصولات نتیجه ی تنوع جنس ها و گونه های محلی و فلور میکروبی بومی ویژه است. ما در این مقاله به بررسی میزان تولید اگزوپلی ساکاریدها جدا شده از ماست و پنیر سنتی ایران می‌پردازیم.

اگزوپلی ساکارید چیست؟

توانایی تولید اگزوپلی ساکارید ها توسط باکتری های اسید لاکتیک به طور گسترده در سال های اخیر مورد مطالعه قرار گرفته است. اگزوپلی ساکاریدها، پلی ساکاریدهای زنجیره بلندی هستند که از واحدهای قندی تشکیل شده اند. این واحدهای قندی عمدتا گلوکز، گالاکتوز و رامنوز در نسبت های مختلف هستند. این ترکیبات در طی مراحل رشد میکربی در محیط رها می شوند و از آنجا که متصل به سطح سلول میکروبی نیستند، می توان آنها را از پلی ساکاریدهای کپسوله شده که متصل به سطح سلول هستند متمایز کرد.

تقسیم بندی اگزوپلی ساکاریدهای میکروبی

اگزوپلی ساکاریدهای میکروبی در دو گروه هموپلی ساکارید ها ( سلولز، دکستران، موتان، آلترنان، پولولان، لوان، کوردلان) و هتروپلی ساکاریدها (ژلان و زانتان) قرار می گیرند .

تقسیم بندی هموپلی ساکاریدها

هموپلی ساکاریدها از واحدهای تکراری یک نوع منوساکارید(  -Dگلوگز یا  -Dفروکتوز) تشکیل شده اند و می توان آنها را به دو گروه عمده تقسیم کرد: گلوکان و فروکتان.

هتروپلی ساکاریدها

هتروپلی ساکاریدها واحدهای تکراری دارند که شباهت ساختاری این واحدها به همدیگر کمتر است.که از واحدهای متعددی از الیگوساکاریدها ساخته شده اند که حاوی سه تا هشت باقیمانده هست .

خواص اگزوپلی ساکاریدها

اگزوپلی ساکاریدها در بهبود رئولوژی، بافت و احساس دهانی محصولات لبنی تخمیری مثل ماست اهمیت ویژه ای دارند. اگزوپلی ساکاریدها در آب حل شده و خواص ژله ای و قوام دهندگی ایجاد می کنند. همچنین در مواد غذایی به عنوان امولسیون کننده، پایدارکننده، سوسپانسیون ذرات، کنترل کریستالیزاسیون و تشکیل فیلم به کار می روند.

غربال لاکتو باسیل ها

جداسازی و شناسایی لاکتوباسیل های گیای محصولات لبنی سنتی ایران امکان معرفی باکتری های مناسب جهت تهیه کشت آغازگر یا کشت همراه فراهم می آورد. لذا هدف از این مطالعه غربال لاکتو باسیل های جدا شده از فراوده های لبنی تخمیری ایران از نظر تولید اگزوپلی ساکارید و خصوصیات تکنولوژیکی است. این باکتری ها می توانند در بهبود بافت، طعم، آروما و همچنین اثرات سلامت بخش محصولات لبنی نقش موثری داشته باشند.

مواد و روش ها

باکتریها و شرایط رشد:در این تحقیق از  ۱۶سویه لاکتوباسیل جدا شده از محصولات لبنی تخمیری سنتی ایران مانند ماست و پنیر استفاده شد. این باکتری ها توسط تاج آبادی و همکاران جداسازی و درگنجینه میکروبی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران مرکزی در دمای -Cº ۸۰ و زیر  ٪۲۵ گلیسرول نگهداری می شوند. سویه ها بر اساس نوع محصول لبنی، منطقه تهیه نمونه و مورفولوژی کلنی کد گذاری شدند. قبل از انجام هر آزمون این باکتریها در محیط ( de Man Rogosa and Sharp)  MRS-Broth در شرایط بی هوازی و دمای  ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت  ۲۴-۴۸ ساعت کشت داده شدند.

اندازه گیری : pH

دستگاه  pHمتر( نوع الترابیسیک ) با محلول های بافر تنظیم و سپس  pHنمونه ها اندازه گیری شد. کشت خطی نمونه ها در محیط کشت   MRS-Agar برای تشخیص خالص بودن سویه ها انجام شد و به مدت  ۴۸ساعت در انکوباتور در حضور  CO2 ٪۱۰ در دمای  ۳۷ .Cگرمخانه گذاری شد. بعد از این مدت سویه ها از نظر مورفولوژی، خالص یا ناخالص بودن مورد بررسی قرار گرفتند.

مشاهدات میکروسکوپی

از کلنی های خالص تشکیل شده بر روی محیط کشت، لام میکروسکوپی به روش رنگ آمیزی گرم تهیه شد. رنگ آمیزی گرم طبق استاندارد شماره  ۲۳۲۵ انجام گرفت. سپس از لام رنگ آمیزی شده توسط میکروسکوپ دوربین دار عکس تهیه گردید.

کاتالاز

طبق استاندارد شماره  ۲۳۲۵ انجام شد.

تولید گاز

پس از تهیه محیط کشت   MRS broth آن را به مقادیر مناسب در لوله های فالکون توزیع و به هر لوله یک لوله دورهام به صورت وارانه اضافه گردید. پس از اتوکلاو محیط های کشت از عدم وجود حباب در لوله های دورهام اطمینان حاصل شد.

به هر لوله  ٪۱از کشت یک شبه لاکتوباسیل های مورد بررسی تلقیح شد و  ۲۴ساعت در دمای  ۳۷درجه سانتیگراد و شرایط بی هوازی گرمخانه گذاری شد تا تخمیر گلوکز همراه با تولید گاز لاکتوباسیل ها بررسی شود. در صورتی که لاکتوباسیل مورد بررسی ناجور تخمیر باشد از تخمیر گلوکز گاز CO2 تولید می شود که مقداری از آن در لوله دورهام به صورت حباب جمع می شود ( استاندارد ۲۳۲۵).

بررسی تولید اگزو پلی ساکارید

در این بررسی اگزوپلی ساکارید متصل به سلول و اگزوپلی ساکارید ترشح شده در محیط کشت بطور جداگانه استخراج و در مقایسه با استاندارد گلوکز تعیین مقدار شدند . به این منظور از کشت یک شبه هر سویه به میزان  ٪۱به محیط  MRS-Broth تلقیح و  ۴۸ساعت در دمای  ۳۷درجه سانتیگراد و شرایط بی هوازی گرمخانه گذاری شد. سپس محیط های کشت در دمای ۴ درجه سانتیگراد و به مدت  ۳۰دقیقه سانتزیفو ژ (۱۵×۱۰۰۰ g) شدند. مایع رویی برای جداسازی اگزوپلی ساکارید رها شده در محیط کشت و ته نشست برای جداسازی اگزوپلی ساکارید باند شده استفاده شد.

جداسازی اگزوپلی ساکاریدهای باند شده به سلول

به ته نشست حاوی سلول های باکتریایی  ml5محلول سرم فیزیولوژی برای شستشو اضافه شد سپس به مدت ۱۵دقیقه در دمای  ۴درجه سانتیگراد سانتریفوژ (۱۵۰۰۰× g) شد. ته نشست  ۲ بار در  ۰.۰۵ ( EDTA ml5مولار) سوسپانس ، و ۴ساعت در انکوباتور شیکردار گرمخانه گذاری شد. و سپس به منظور جدا کردن مواد نامحلول سوسپانسیون در ۶۰۰۰ g به مدت  ۳۰ دقیقه و دمای  ۴ درجه سانتیگراد سانتریفوژ شد. سپس به منظور رسوب اگزوپلی ساکارید باند شده به مایع شفاف رویی حاصل از سانتریفوژ اتانل سرد اضافه شد. عمل رسوب سازی اگزوپلی ساکارید باند شده به مدت  ۲۴ ساعت و در دمای ۴ درجه سانتیگراد انجام شد. برای جداسازی اگزوپلی ساکارید رسوب یافته از سانتریفوژ با دور  ۶۰۰۰ g در دمای  ۴ درجه سانتیگراد و زمان  ۳۰ دقیقه استفاده شد. دراین مرحله مایع شفاف رویی دور ریخته شد و ته نشست حاوی اگزوپلی ساکارید باند شده در محیط آزمایشگاه خشک شد . به منظور اطمینان از نتایج تمام آزمایشات  ۳بار تکرار شد.

سنجش اگزوپلی ساکارید باند شده با اسپکتروفتومتری

رسوب حاصل در  ۱۰میلی لیتر آب مقطر حل شد و مقدار کربوهیدرات کل از طریق روش فنل/اسید سولفوریک و روش گلوکز به عنوان استاندارد تعیین شد. در این روش رویml 0/5 ته نشست حاوی اگزوپلی ساکارید محلول در آب مقطر ، ml0.5 فنل  ۵ درصد و  ml2.5 اسید سولفوریک غلیظ ریخته شد. محلول وورتکس، و پس از اینکه دمای آن به دمای اتاق رسید با اسپکتروفتومتر در طول موج  ۴۹۰جذب آنها خوانده شد.

با استفاده از منحنی استاندارد گلوکز انتخاب برترین سویه تولید کننده اگزوپلی ساکارید باند شده انجام گرفت. در این روش جهت تهیه محلول استوک گلوکز   mg 10 آلفا – د گلوکز در  ml 80 آب مقطر حل و  ml 100 محلول استوک گلوکز تهیه گردید. پس از افزودن غلظت های  ، ۱۰ ، ۸ ، ۴ ، ۳ ،۲ ،۱و ml 20 از محلول استوک گلوکز به بشرهای مختلف ، سپس با آب مقطر حجم محلول نهایی به ۲۰ mlرسید از هر بشر  ml 0.5 محلول با سمپلر برداشته و داخل لوله آزمایش ریخته و به هر لوله ml0.5 فنل و  ml2.5اسید سولفوریک غلیظ اضافه کردیم و پس از وورتکس و رسیدن محلول به دمای محیط با اسپکتروفتومتر درطول موج  ۴۹۰ جذب نمونه ها خوانده شد.

جداسازی و شناسایی اگزوپلی ساکارید رها شده در محیط

برای جداسازی اگزوپلی ساکاریدها آزاد شده در محیط کشت مایع رویی به دست آمده از  ۱۰میلی لیتر نمونه سانتریفوژ و سپس با تری کلرو استیک اسید با غلظت  ۲۰ درصد عمل آوری شد و در دمای  ۴درجه سانتیگراد به مدت  ۴ ساعت در انکوباتور شیکردار گرمخانه گذاری شد . پروتئین های ته نشین شده پس از و در دمای  ۴ درجه سانتیگراد به مدت  ۴ساعت گرمخانه گذاری می شود که در طی این مدت با یک همزن به آرامی هم زده می شود . پروتئین های ته نشین شده پس از ۲۰ دقیقه از طریق سانتریفوژ  ۲۵۰۰۰ g برای جدا گردید سپس به منظور رسوب اگزوپلی ساکارید باند شده به مایع شفاف رویی حاصل از سانتریفوژ اتانل سرد اضافه شد.

عمل رسوب سازی اگزوپلی ساکارید باند شده به مدت  ۲۴ساعت و در دمای  ۴ درجه سانتیگراد انجام شد. برای جداسازی اگزوپلی ساکارید رسوب یافته از سانتریفوژ با دور  ۶۰۰۰ g در دمای  ۴درجه سانتیگراد و زمان  ۳۰ دقیقه استفاده شد و ته نشست حاوی اگزوپلی ساکارید رها شده در محیط، پس از خشک شدن در محیط ازمایشگاهی برای سنجش با روش فنل / اسید سولفوریک در آب مقطر حل شد .

به منظور اطمینان از نتایج تمام آزمایشات  ۳بار تکرار شد. اگزوپلی ساکارید های رها شده در محیط طبق روشی که در بالا برای اگزوپلی ساکارید باند شده توضیح داده شد سنجش شد. در این تحقیق تجزیه و تحلیل اطلاعات و رسم نمودارها با کمک نرم افزارهای   SPSSو  EXELانجام شده است.

نتایج

لاکتوباسیل ها بر اساس منشاء نمونه و مورفولوژی کلنی کد گذاری شدند. لاکتوباسیلها جدا شده از پنیر و ماست از نظر واکنش گرم ، تست کاتالاز ، تولید گاز و  pHمورد بررسی قرار گرفتند. لاکتوباسیل ها ، گرم مثبت و کاتالاز منفی بودند. رنگ آمیزی گرم لاکتوباسیل ها طبق استاندارد انجام شد.

شناسایی بیوشیمیایی سویه های برتر باکتریایی:  ۱۶سویه مقاوم به اسید و املاح صفراوی انتخاب شده از مرحله قبل بر اساسصفات بیوشیمیایی مثل رشد در دمای  ۱۵درجه سانتیگراد، تولید اسید و گاز از تخمیر گلوکز، تولید NH 3 از آرژنین و درنهایت توانایی تخمیر قندهای مختلف بر اساس دستورالعمل کتاب برگی شناسایی شدند.

جداسازی وشناسایی اگزوپلی ساکاریدهای باند شده به سلول

از  ۱۶سویه لاکتوباسیلوس جدا شده از پنیر و ماست  ۹سویه توانایی تولید  EPS باند شده را داشتند که از بین آنها  ۶سویه قادر به تولید بیشتر از EPS 50 mg/l باند شده بودند. در بین سویه جدا شده از پنیرهای محلی مختلف، بیشترین میزان تولید   EPS باند شده به  mg/l) 364 c2h1) وکمترین میزان به  ( mg/l4 (c 6l2تعلق داشت. در این مطالعه از هر محصول، برای شناسایی ساختار اگزوپلی ساکارید دو سویه که بالاترین میزان تولید اگزوپلی ساکارید باند شده را داشت انتخاب شد به این ترتیب c که از نمونه های پنیر به ترتیب سویه 5i4 ) 364 mg/l  (c2 h1) 173 mg/l)  انتخاب شد .

شناسایی و جدا کردن اگزوپلی ساکاریدهای رها شده در محیط:

از  ۱۶سویه لاکتوباسیل مورد آزمایش  ۹سویه قادر به تولید  EPSرها شده در محیط بودند که از بین آنها ،  ۴سویه بیشتر از Mg/l500 اگزوپلی ساکارید رها شده در محیط را تولید کردند. در بین سویه ها جدا شده از پنیرهای محلی بیشترین میزان در این مطالعه از هر محصول، برای شناسایی ساختار اگزوپلی ساکارید، دوسویه که بالاترین میزان تولید اگزوپلی ساکارید رها شده در محیط را داشت انتخاب شد.

مکانیسم تولید اگزوپلی ساکارید

اگزوپلی ساکارید های تولید شده توسط لاکتوباسیل ها بر حسب وضعیت خارج سلولی یا داخل سلولی به دو روش سنتز می شوند. فرایند بیوسنتز تعداد کمی از هموپلی ساکاریدها مثل دکستران ، موتان ، آلترنان و لوان خارج سلولی است و نیازمند سوبسترای ساکارز می باشد و آنزیم های گلیکوزیل ترانسفراز ( مثل دکستران سوکراز برای بیوسنتز دکستران و لوان سوکراز برای بیوسنتز لوان) در واکنش پلیمریزاسیون درگیرند.

انرژی موردنیاز برای پلیمریزاسیون از هیدرولیز ساکارز تامین می شود. این هموپلی ساکاریدها در خارج از سلول توسط گلیکان سوکراز خارج سلولی متعلق به رده گلیکوترانسفرازها (GTF) سنتز می شود.

آنزیم های متعلق به گروه گلیکوزیل ترانسفرازها ( GTF) بر حسب محصولات تولیدی شان یا ترانس گلوکوزیداز هستند و یا ترانس فروکتوزیداز هستند.دکستران سوکراز، موتان سوکراز و روتران سوکراز متعلق به گروه ترانس گلوکوزیدازها هستند. آنها پروتئین های خارج سلولی با وزن مولکولی بالا هستند که منحصرا توسط ژن   gftرمزگذاری می شوند. آنها دو واکنش را کاتالیز می کنند.

هیدرولیز ساکارز ، که در آنجا گلوکز به عنوان سوبسترای جدید است و انتقال گلیکوزیل روی ترکیب هتروپلی ساکارید ها در اثر پلیمریزاسیون پیش سازهای واحدهای تکراری در سیتوپلاسم تشکیل می شوند. چندین نوع آنزیم و پروتئین در بیوسنتز و ترشح    EPS نوع هترو درگیرند که برای تشکیل   EPSچندان ضروری نیستند. نوکلئوتیدهای قندی که از قند  -۱فسفات مشتق شده اند در بیوسنتزهتروپلی ساکاریدها نقش مهمی دارند که این نقش مهم به دلیل فعال سازی قندهاست که برای پلیمریزاسیون قندها و تبدیل قند ( اپیمریزاسیون ، دکربوکسیلاسیون ، دهیدروژناسیون و غیره) ضروری است.

فعال سازی قند و تغییر آنزیم ها در تشکیل بلوک های سازنده و در نهایت ترکیب   EPSنقش تعیین کننده ای دارند . در این مطالعه، سویه های موجود، از ماست و پنیر جدا شده و متعلق به سویه های لاکتوباسیل ها بودند و طبق مطالعاتی که انجام شد تمام سویه های جدا شده ازاین محصولات مورد مطالعه، توانایی تولید   EPS را داشتند. این محصولات در شمال و شمال غرب ایران به صورت محلی تولید می شوند و برای هر یک از این محصولات در طی فرآوری از تکنیک های مختلفی استفاده می شود.

این تحقیق برای اولین بار جداسازی   EPS را از دو محصول لبنی ایران (ماست و پنیر) گزارش می دهد. سویه های جدا شده، پلی ساکارید سنتز و ترشح می کنند و روی محیط  MRSآگار فنوتیپ موکوئیدی از خود نشان می دهند.

زمانی که این سویه ها در محیط  MRS-Broth رشد می کنند دو جزء EPS تولید می کنند :

جزء اول که از مایع رو جدا شده و  EPS آزاد را تشکیل می دهد،

جزءدوم که از ته نشست حاصل از سانتریفوژ محیط کشت براث جداشده و  EPS باند شده را تشکیل می دهد.

گرمخانه گذاری ،ته نشست با  ۰.۱ EDTA مولار اجازه جداسازی  EPS باند شده را فراهم می آورد.

برخی از مطالعات نشان داده که تولید  EPSتوسط باکتری های اسید لاکتیک( (LABممکن است تحت تاثیر شرایط محیط کشت ( منبع کربن و منبع نیتروژن ) و شرایط گرمخانه گذاری قرار داشته باشد. ما در این مطالعه از محیط کشت –MRS  Brothاستفاده کردیم تا فنوتیپ های تولید کننده   EPS را افزایش دهیم با این حال فنوتی های تولید کننده   EPS محصولات ماست نسبت به پنیر محدود بود.

بیشتر مطالعات انجام شده در اکثر کشورها فقط در زمینه تولید  EPS متمرکز بوده و نوع    EPS (باند شده یا آزاد ) مشخص نشده، به عنوان مثال در نیجریه سویه های   LAB را ازبرخی محصولات لبنی تخمیری و غیرلبنی تخمیری برای تولید   EPS غربال کردند این محققان بجز لاکتوباسیل ها میزان تولید   EPS توسط لکونوستوک ها را بررسی کردند. همینطور از dahi ( محصول تخمیری لبنی هندی ) و شیر تخمیر شده در هند چندین سویه  LAB مزوفیل تولید کننده   EPS جدا شد که نوع   EPS (باند شده و آزاد ) مشخص نبود و تماما لاکتوباسیل نبودند بلکه این محققین برخی از سویه های لکونوستک و انتروکوکوس تولید کننده   EPSرانیز مشخص کردند.

در این تحقیق  ۹سویه از نظر تولید   EPS باند شده و آزاد مورد بررسی قرار گرفت و مطالعات به دست آمده نشان داد که تمام سویه های مورد مطالعه توانایی تولید  EPS (باند شده و آزاد) را داشتند از طرف دیگر تمام سویه های جدا شده از محصولات لبنی ایران، سویه های لاکتوباسیل بودند.

همچنین بیشتر مطالعات انجام شده در زمینه تولید   EPS باند شده و آزاد ، بر روی یک سویه مشخص انجام شده بود برای مثال از دانه کفیر فقط یک سویه تولید کننده  EPS(کفیران) را جدا کردند. و در بررسی دیگر فقط از یک سویه لاکتوباسیلوس پلانتاروم  EP 56 که از سیلاژ ذرت جدا شده بود دو نوع  EPS باند شده و آزاد جدا کردند. اگزوپلی ساکاریدها در آب حل شده و خواص ژله ای و قوام دهندگی ایجاد می کنند؛ همچنین در مواد غذایی به عنوان امولسیون کننده، پایدارکننده، سوسپانسیون ذرات، کنترل کریستالیزاسیون، تشکیل فیلم و ان کپسوله کردن به کار می روند .

برای تولید ماست، نوشیدنی های ماستی، پنیر، خامه تخمیر شده، دسرهای بر پایه شیر  LABتولید کننده اگزوپلی ساکارید دارای اهمیت زیادی هستند   EPS ها به بافت، احساس دهانی، درک مزه و پایداری محصول نهایی کمک می کنند.

برخی از این اگزوپلی ساکاریدها اثر سلامت بخشی بر انسان دارند؛ به عنوان مثال، کلسترول خون را کاهش می دهند، فعالیت ضد توموری دارند، تحریک کننده سیستم ایمنی هستند، همچنین به مدت طولانی در بخش دستگاه گوارشی باقی می مانند و اثر پری بیوتیکی دارند. همچنین استارترهای تولید کننده  EPS در تولید پنیر موزارلای کم چرب به خاطر حفظ رطوبت استفاده شدند.

نتایج این مطالعات نشان داد که لاکتوباسیل های جدا شده از محصولات لبنی سنتی ایران دارای توانایی تولید   EPS به صورت آزاد و باند شده می باشد در نتیجه امکان استفاده از این باکتری ها به عنوان استارتر و یا کشت همراه جهت بهبود خواص رئولوژیکی فراورده های غذایی وجود دارد. با استفاده از  LABتولید کننده  ، EPS تقاضای مصرف کنند گان برای محصولات لبنی طبیعی با بافت خامه ای و نرم ، قند و چربی کمتر بر آورده می شود.

موفقیت در کاربرد  EPS از طریق توانایی آن برای اتصال با آب ، واکنش با پروتئین ها و افزایش ویسکوزیته فاز سرمی شیر تعیین می شود.با استفاده از  EPS به عنوان بافت دهنده و پایدار کننده می توان مصرف برخی افزودنی های شیمیایی را کاهش داد.اگر چه مکانیسم واکنش ها بین   EPS و ترکیبات شیر در محصولات تخمیری آن چنان شناخته شده نیست ویسکوزیته و بار  EPS خواص نهایی محصول نهایی را تعیین می کند.

این تحقیق توسط واحد علوم و تحقیقات دانشکده علوم و مهندسی صنایع غذائی دانشگاه آزاد اسلامی تهران ، انجام گرفته است. با تشکر از زحمات این عزیزان.

مطالب مرتبط: