تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز از آب پنیر

ما در این مقاله به بررسی تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز از آب پنیر توسط مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس می‌پردازیم. بر اساس نتایج مطالعه حاضر، آب پنیر محیط مناسبی برای تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز توسط مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس در حضور عصاره مخمر و مکمل های سولفات منیزیم و منگنز است.

آنزیم بتاگالاکتوزیداز چیست؟

آنزیم ها ترکیباتی پروتئینی هستند که به منزله کاتالیزورهای حیاتی ممکن است سبب تغییرات مطلوب یا نامطلوب فیزیکی و شیمیایی در مواد غذایی شوند. آنزیم بتاگالاکتوزیداز از خانواده گلیکوزیل هیدرولازها است که قادر به هیدرولیز پیوندهای آلفا-دی گالاکتوزیدها، آلفا-ال آرابـیـنوزیدها و آزاد کردن آنها به هِمی استال است. وزن مولکولی این آنزیم تقریباً  ۷۶ کیلو دالتون و برای فعالیت، به یونهای فلزی منیزیم، منگنز و پتاسیم نیاز دارد. این آنزیم از حیوانات، گیاهان و میکروارگانیسم ها به دست می آید و انواع میکروبی آن در مقایسه با منابع حیوانی وگیاهی به میزان بیشتری تولید می شوند و کاربرد زیادی در صنعت و فناوری دارند .

در سه دهه اخیر کاربرد بتاگالاکتوزیداز در هیدرولیز لاکتوز در صنعت محصولات لبنی بسیار مورد توجه قرار گرفته است. امروزه پساب کارخانه های تولیدکننده فرآورده های لبنی به ویژه صنایع پنیرسازی از دیدگاه زیست محیطی مسئله ای پر اهمیت محسوب میشود.

آب پنیر

آب پنیر یکی از محصولات جانبی کارخانه های لبنی است که باوجود ترکیبات مغذی متعدد در آن (لاکتوز، پروتئین، مواد معدنی، اسیدهای آلی، ویتامین) اغلب جزء ضایعات کارخانه های لبنی به شمار میرود. لذا استفاده از سویه های میکروبی مناسب به منظور به کارگیری بهینه این منبع ارزان در جهت تولید انواع فرآورده های بیولوژیکی در کاهش هزینه های تولید و کاهش آلودگی های زیست محیطی امری ضروری است.

با توجه به اینکه گونه های مختلف میکروبی قادر به تولید این آنزیم می باشند، انتخاب میکروارگانیسم مناسب جهت تولید این آنزیم از بین گونه های بی خطر برای استفاده انسانی بسیار مهم است . از این رو تحقیقاتی در زمینه تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز با به کارگیری پودر آب پنیر توسط میکروارگانیسم هایی نظیر آسپرژیلوس اورایزا (  Santos  ، et al., 2017) کلویورومایسس لاکتیس (.,You et al ،۲۰۱۷) لاکتوباسیلوس روتری (  Li  et al 2015 ) استرپتوکوکوس ترموفیلوس( Princely et al 2013) و غیره، صورت گرفته است. کلویورومایسس مارکسیانوس یک میکروارگانیسم سالم و امن در صنعت غذا به شمار میرود (Belem and Lee, 1998) و با توجه به تحمل دامنه حرارتی بالا، سرعت بالای رشد اهمیت تکنولوژیکی بالایی دارد( .,Manera et al 2008) این مخمر از جمله تولیدکنندگان آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور لاکتوز گزارش شده است.

از آنجا که تاکنون تحقیقی در رابطه با تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز توسط سویه های (  BY101و GY101) مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس از آب پنیر، به عنوان منبع لاکتوز صورت نگرفته است در این تحقیق به تولید و بررسی پارامترهای مؤثر بر تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز از آب پنیر توسط میکروارگانیسم های مذکور پرداخته شده است.

مواد و روش کار

در این مطالعه، جهت تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز از دو سویه  BY101و  GY101که بیشترین تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز را طی غربالگری اولیه نشان داده اند استفاده شد.

به منظور فعال سازی مخمرها از محیط کشت  YPG براث حاوی ۱۰گرم گلوکز،  ۴ گرم عصاره مخمر و  ۶ گرم پپتون در هر لیتر آب مقطر استفاده شد. آب پنیر مورد نیاز از کارخانه لبنیات شیمبار (شهرکرد، ایران) تهیه و در ظروف استیل در دمای  -۱۸درجه سانتیگراد تا زمان مصرف نگهداری گردید. جهت استفاده، پس از رفع انجماد و یکنواخت کردن کامل آن، مقدار لازم از آب پنیر در ظرف استریل ریخته شد و در بن ماری ۸۵ درجه سانتیگراد به مدت  ۲۰دقیقه حرارت دهی گردید. در ادامه،  ۵۰ میلیلیتر از آب پنیر خنک شده به ارلن های  ۲۵۰میلیلیتری استریل، منتقل و پس از تلقیح با مخمر ( ۲درصد)، به منظور بررسی دمای مناسب تولید آنزیم، در دمای  ۳۷درجه سانتیگراد و یا ۳۰درجه سانتیگراد با دور هوادهی  ۱۰۰دور در دقیقه به مدت  ۱۴۴ساعت گرمخانه گذاری شدند و در زمان های  ۱۲۰ ،۹۶ ،۴۸ ،۲۴و  ۱۴۴ساعت نمونه برداری انجام گردید و آزمون های اندازه گیری پروتئین و فعالیت آنزیمی انجام شد.

بررسی اثر مکمل های معدنی و عصاره مخمر بر فعالیت آنزیم

در این مطالعه پس از بهینه سازی دما از عصاره مخمر ( ۰/۲و  ۰/۵درصد)، سولفات منگنز ( ۰/۵درصد) و سولفات منیزیم ( ۰/۵درصد) به عنوان مکمل در افزایش تولید آنزیم استفاده شد.

سنجش فعالیت آنزیم

مقدار  ۵۰ میکرولیتر از نمونه های سانتریفوژ شده ( ۱۰۰۰دور در دقیقه،  ۵دقیقه) به همراه ۱۵۰میکرولیتر بافر به مدت   ۵دقیقه در هاتپلیت در ۳۷درجه سانتیگراد قرار داده شدند. سپس ۱۰۰میکرولیتر از سوبسترا  (با غلظت  ۴میلیگرم در میلیلیتر) به آن اضافه گردید و به محض ظهور رنگ زرد و ثابت شدن آن، میزان۱۰۰ میکرولیتر محلول کربنات سدیم  ۰/۱مولار افزوده شد. پس از آن، جذب محلول با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر (مدل ،SUV2100یونیک امریکا) در طول موج  ۴۳۰ نانومتر اندازه گیری شد. در نمونه شاهد به جای نمونه تخمیری از آب مقطر استفاده گردید. در نهایت میزان فعالیت آنزیم بر اساس یونیت در میلیلیتر (U/mL) گزارش گردید.

اندازه گیری پروتئین

برای سنجش پروتئین از روش برادفورد (کمپانی بایورد) استفاده شد.  ۲۰میکرولیتر از نمونه با  ۲۰۰میکرولیتر از محلول بایورد و  ۷۸۰میکرولیتر آب مقطر مخلوط شد و پس از  ۱۵دقیقه میزان جذب در طول موج ۵۹۵ نانومتر قرائت شد و میزان پروتئین به صورت گرم بر میلیلیتر محاسبه شد .

آنالیز آماری

در این مطالعه کلیه آزمایش ها در قالب طرح آزمایشی کاملاً تصادفی و در ۳ تکرار انجام شد. میانگین ها با نرم افزار  SPSS 21و بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال  ۵درصد مقایسه شدند. نمودارهای حاصل در نرم افزار  Excel 2013رسم گردید و مورد مقایسه و بررسی قرار گرفتند.

نتایج

اثر دما بر تغییرات فعالیت آنزیم

در بخش اول این مطالعه اثر دو دمای  ۳۰و  ۳۷درجه سانتیگراد بر میزان تولید آنزیم در طی تخمیر بررسی و میزان پروتئین آن اندازهگیری شد. با افزایش دما میزان تولید پروتئین کاهش یافت و میزان فعالیت آنزیمی در دماهای مختلف ارتباط معنیداری را نشان داد . به طوری که میزان فعالیت آنزیمی در ۳۰درجه سانتیگراد برای هر دو سویه نسبت به دمای ۳۷درجه سانتیگراد به مراتب بیشتر بود. نمودارهای ۱ و  ۲به ترتیب تأثیر دمای  ۳۰و  ۳۷درجه را بر تولید آنزیم نشان میدهند و نمودارهای  ۳و  ۴ به ترتیب تأثیر دمای  ۳۰و  ۳۷ درجه سانتیگراد را بر تولید پروتئین نشان میدهند.

اثر مکملهای معدنی بر تولید آنزیم

نتایج نشان داد که افزودن مکملهای سولفات منگنز و سولفات منیزیم بر میزان افزایش فعالیت آنزیمی تأثیر معنی دار دارد . میزان فعالیت آنزیمی نمونه ها با افزودن مکمل های معدنی روند افزایشی داشت به طوری که پس از  ۱۴۴ساعت به بیشترین میزان خود رسید. در میان تیمارهای مورد مطالعه، تیمار GY101 حاوی مکمل سولفات منیزیم نسبت به تمامی تیمارها دارای بالاترین (۲/۱۲±۰/۲۱ U/mL) و پس از آن تیمار  BY101 حاوی سولفات منیزیم (  U/mL1/94±۰/۱۹) بالاترین فعالیت آنزیمی را نشان داد  و تیمار  BY101بدون مکمل معدنی کمترین( U/mL 1/55±۰/۱) میزان فعالیت آنزیمی را نشان دادند.

بر اساس نتایج به دست آمده در این تحقیق افزودن سولفات منیزیم نسبت به سولفات منگنز تأثیر بیشتری بر میزان فعالیت آنزیمی داشته است به طوری که با افزودن  ۵درصد وزنی سولفات منیزیم به محیط کشت GY101پس از  ۱۴۴ساعت میزان فعالیت آنزیمی ۲/۱۲±۰/۲۱ U/mLو برای سولفات منگنز  U/mL1/91±۰/۰۹ بوده است .

تأثیر عصاره مخمر بر تغییرات فعالیت آنزیم

نتایج به دست آمده از آنالیز واریانس نشان داد که غلظت های مختلف ( ۲/۰و  ۵/۰درصد) عصاره مخمر بر روی فعالیت آنزیم تأثیر معنی دار دارد. همچنین، با افزایش میزان درصد عصاره مخمر از ۲/۰ درصد به  ۵/۰درصد، فعالیت آنزیمی پس از ۱۴ساعت افزایش یافت به طوری که میزان فعالیت آنزیمی سویه  GY101حاوی  ۲/۰درصد بعد از  ۱۴۴ساعت، ±۶۵/۱ ۵۷/0U/mL بود که با افزایش میزان عصاره به ۵/۰درصد، میزان آن به  ۱۴/۰±۲۵/۲ U/mLافزایش یافت.

بحث

یکی از موارد مهم در جهت ارزشمند نمودن پروسه تولید یک محصول بیولوژیک، مدت زمان بهینه و کوتاه برای تولید فرآورده و وجود بستر رشد مناسب برای میکروارگانیسم است؛ بنابراین یافتن گونه هایی که دارای توانایی بالقوه در این زمینه می باشند حائز اهمیت و مورد توجه است. این میکروارگانیسم ها دارای توانایی

رقابت با سایر میکروارگانیسم های صـنعـتی میباشند، پس میتوان با ادامه تحقیقات، آنها را جایگزین باکتری های استارتر نموده و پروسه تولید را از نظر اقتصادی مقرون به صرفه نماییم.

چرا آنزیم بتاگالاکتوزیداز ؟

از آنجا که آنزیم بتاگالاکتوزیداز آنزیم های گران قیمت به شمار میرود و از سوی دیگر در سالهای اخیر مصرف آن در صنعت لبنیات افزایش یافته است، استفاده از یک منبع ارزان مثل آب پنیر در فرآیند تولید آن حائز اهمیت است؛ بنابراین این مطالعه باهدف ایجاد شرایط بهینه برای مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس به منظور تولید آنزیم از آب پنیر مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که دو گونه مخمر  GY10و  BY101مورد مطالعه، در دماهای پائین، فعالیت بیشتری از خود نشان دادند و برای فعالسازی آنها نیاز به حرارت بالا نیست؛ بنابراین از یک طرف باعث صرفه جوئی در انرژی و از طرف دیگر باعث افزایش فعالیت آنزیم گردید؛ بنابراین نتایج این بررسی بیانگر این است که استفاده از دمای  ۳۰درجه سانتیگراد، عصاره مخمر  ۰/۵ درصد و مکمل های منگنز و منیزیم سولفات  ۰/۵ درصد، سبب افزایش میزان فعالیت آنزیم به وسیله مخمر شده اند، به طوری که افزودن مکمل عصاره مخمر  ۰/۵ درصد بعد از گذشت  ۱۴۴ساعت بالاترین تولید آنزیم را توسط مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس داشته است.

با مقایسه میزان فعالیت آنزیمی در دو دمای  ۳۰و ۳۷ درجه سانتیگراد ارائه شده در نمودار  ۱و  ۲ مربوط به هر سویه مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس به روشنی کاهش میزان تولید آنزیم با افزایش دما قابل ملاحظه است. همچنین مقایسه میزان فعالیت آنزیمی در نمودارهای  ۱و  ۲ نشان دهنده این مطلب است که در هر دو دمای مورد بررسی و شرایط یکسان سویه  GY101 فعالیت بالاتری نسبت به سویه  BY101در تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز نشان داده است.

تحقیقات یائو

یائو و همکاران (۲۰۱۲ ) فعالیت آنزیمی آنزیم فیتاز را در سه دمای  ۴۰ ،۳۰و  ۵۰ درجه سانتیگراد بررسی کردند، نتایج نشان داد که میزان تولید آنزیم با افزایش دما کاهش معنی داری دارد. که نتایج مطالعه حاضر نیز با نتایج به دست آمده از مطالعه یائو و همکاران مطابقت دارد.

تحقیقات ریچاردسون

این نتایج با نتایج ریچاردسون و همکاران (۲۰۱۲) که بر روی جداسازی باکتری های تولید کننده آنزیم فیتاز و بهینه سازی تولید آنزیم کار کرده اند، مطابقت دارد. در این مطالعه آنها تأثیر دما را برای تعیین بهترین سویه مورد بررسی قرار دادند که نتایج آنها نشان داد در دمای کمتر، سویه ها دارای فعالیت آنزیمی بالاتری نسبت به دماهای بالاتر هستند.

نتایج بررسی میزان تولید پروتئین در دو دمای  ۳۰و  ۳۷ درجه سانتیگراد نشان داد که میزان تولید پروتئین طی مدت زمان مورد بررسی روندی افزایشی داشته است. به طوری که پس از  ۱۴۴ساعت حداکثر مقدار پروتئین موجود در محلول مربوط به سویه  GY101و معادل  ۹/۹ میکروگرم بر میلی لیتر بوده است که نسبت به میزان پروتئین تولیدی توسط سویه  BY101در شرایط یکسان بیشتر بوده است. با مقایسه نمودارهای ۳ و  ۴ میتوان دریافت که با افزایش دما از  ۳۰ به ۳۷ درجه میزان تولید پروتئین کاهش یافته است که این نشان دهنده تأثیر معنی دار دما بر روی میزان تولید پروتئین است.

نتایج تحقیق زمانی

نتایج تحقیق صورت گرفته توسط زمانی (۱۳۷۹) جهت تعیین فاکتورهای بهینه در رشد مخمر کلویورومایسس فراژیلیس به منظور تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز نشان داد که دما،  pH و سرعت هوادهی از جمله عوامل محیطی تأثیرگذار در راستای بهینه سازی محیط کشت هستند و شرایط بهینه رشد مخمر کلویورومایسس فراژیلیس به منظور تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز را دمای  ۳۰درجه سانتیگراد،  pH برابر با  ۸/۶و میزان هوادهی  ۱۰۰دور در دقیقه شناسایی نمودند. بالاترین مقدار بتاگالاکتوزیداز تولید شده توسط مخمر مورد استفاده، در محیطی شامل  ۱۰ درصد لاکتوز به عنوان منبع کربن به دست آمد. نتایج این مطالعه همچون مقاله ی حاضر، نشان میدهد که تخمیر در دمای کمتر باعث تولید فعالیت آنزیم بیشتری گردیده است.

تأثیر غنی سازی محیط کشت با ترکیبات معدنی

بررسی تأثیر غنی سازی محیط کشت با ترکیبات معدنی مختلف بر میزان تولید آنزیم نشان دهنده روند افزایشی میزان فعالیت آنزیمی نمونه ها با افزودن مکمل های معدنی است به طوری که میزان فعالیت آنزیمی پس از  ۱۴۴ ساعت به بیشترین میزان خود رسید و به کارگیری سولفات منیزیم نسبت به سولفات منگنز تأثیر بیشتری بر افزایش فعالیت آنزیمی داشته است.

نتایج تحقیق چی و زائو

چی و زائو (۲۰۰۳) در بررسی شرایط بهینه برای تولید پلولان از مخمر رودوترولاباکاروم به محیط کشت مورد استفاده ۸ درصد گلوکز،  ۲ درصد سویای هیدرولیز شده، ۰/۵ درصد پتاسیم سولفات،  ۰/۱درصد نمک سدیم کلراید،  ۰/۲درصد منیزیم سولفات و  ۰/۲۶درصد آمونیوم سولفات اضافه نمودند. نتایج نشان داد که افزودن مکمل هایی همچون منگنز سولفات، گلوکز، سویای هیدرولیز شده، پتاسیم سولفات، سدیم کلراید، آمونیوم سولفات و منیزیم سولفات جهت تولید پولولان توسط مخمر نسبت به نمونه شاهد افزایش معنی داری حاصل نموده است. که این نتایج نیز با نتایج مطالعه حاضر (Chi and Zhao,  ۲۰۰۳) مطابقت دارد.

تأثیر عصاره مخمر بر تغییرات فعالیت آنزیمی

در بررسی تأثیر عصاره مخمر بر تغییرات فعالیت آنزیمی نتایج نشان داد که با افزایش میزان درصد عصاره مخمر از  ۰/۲درصد به  ۰/۵درصد میزان فعالیت آنزیمی افزایش یافته است که این نتایج نشان دهنده تأثیر مثبت افزودن عصاره بر میزان فعالیت آنزیمی است. همچنین مقایسه تأثیر عصاره مخمر ( ۵درصد) بر تغییرات فعالیت آنزیمی با به کارگیری دو سویه مختلف نشان داد که پس از  ۱۴۴ساعت فعالیت آنزیمی در تیمار حاوی سویه  GY101نسبت به تیمار حاوی سویه  BY101 بیشتر است. نتایج تحقیقات چی و همکاران  (۲۰۰۷) در بررسی شرایط بهینه تولید آنزیم آلکالین پروتئیناز توسط مخمر آئروبازیدیوم پولولانس نشان داد که با افزودن عصاره مخمر و افزایش درصد به کارگیری آن از  ۲به  ۴درصد، میزان تولید آنزیم افزایش می یابد. نتایج تحقیق حاضر نیز تولید بیشتر آنزیم را طی افزایش عصاره مخمر نشان داد.

تحقیقات جوکار و محمدزاده

جوکار و همکاران (۱۳۸۳) مطالعه ای جهت تعیین شرایط بهینه تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز توسط لاکتوباسیلوس دلبروکی به منظور تولید شیر با لاکتوز هیدرولیز شده انجام دادند. نتایج نشان داد که عصاره مخمر و پودر آب پنیر بر میزان تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز تأثیر قابل ملاحظه ای دارد. همچنین محمدزاده و همکاران (۱۳۹۳) به بررسی سینتیک و بهینه سازی شرایط رشد مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس به منظور تولید بیوامولسیفایر مانان، با استفاده از پودر آّب پنیر پرداختند. نتایج نشان داد بهینه سازی عوامل مؤثر با روش سطح پاسخ، شرایط مناسب تولید مانان را، با بیشینه ( ۲۰۹/۲۳میلی گرم در  ۱۰۰میلیلیتر محیط) در غلظت های  ۵۲/۶۰ گرم بر لیتر لاکتوز،  ۱۰/۳۸ گرم بر لیتر عصاره مخمر،  pHبرابر  ۵/۳۶ و دمای  ۳۱/۹۰ درجه سانتیگراد با سرعت بیشینه رشد ویژه ( ۰/۴۰۱بر ساعت) دارد.

نتیجه گیری

مخمر کلویورومایسس مارکسیانوس در این تحقیق نشان داد که در حضور عصاره مخمر ( ۰/۵درصد) و مکمل های سولفات منگنز و سولفات منیزیم (۰/۵ درصد)، توانایی بالایی برای تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز دارد. نتایج حاصله از آزمایش های صورت گرفته حاکی از آن بود که دو گونه مخمر  GY101و  BY101 مورد مطالعه، در دماهای پایین، فعالیت بالاتری نسبت به دمای بالا از خود نشان دادند. بررسی اثر دما بر میزان تولید آنزیم نشان داد که میزان تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز با افزایش دما کاهش یافته است.

همچنین افزودن مکمل های سولفات منگنز و سولفات منیزیم جهت تولید بتاگالاکتوزیداز توسط دو گونه مخمر  GY10و  BY101 سبب افزایش معنی داری در تولید این آنزیم نسبت به نمونه شاهد گردید. در حالیکه مکمل منیزیم سولفات نسبت به سولفات منگنز اثر بیشتری بر افزایش فعالیت آنزیمی داشته است. بررسی ها نشان داد افزایش عصاره مخمر سبب تولید بیشتر آنزیم توسط هر دو گونه مخمر گردید و با افزایش درصد عصاره مخمر میزان فعالیت آنزیمی افزایش مییابد. نتایج این تحقیق نشان داد دو سویه  GY10 و  BY101 در حضور عصاره مخمر و مکمل هایی نظیر سولفات منیزیم و منگنز و در محیط آب پنیر به خوبی میتواند جهت تولید آنزیم بتاگالاکتوزیداز بکار گرفته شود.

این پژوهش توسط گروه علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی،دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، انجام گرفته است. با تشکر از زحمات ایشان.

مطالب مرتبط: