شير مملو از پروتئين، چربي و انواع ويتامين ها است. امروزه شير و فرآورده هاي آن در تغذيه انسان نقش مهمي را ايفا مي كنند. مصرف شير و فرآورده هاي آن در جهان به سرعت رو به افزايش است. يكي از مهمترين محصولات بدست آمده از شير ماست مي باشد. طبق تعريف ماست فرآورده تخميري حاصل از شير است كه حاوي دو باكتري لاكتوباسيلوس بولگاريكوس و استرپتوكوكوس ترموفيلوس مي باشد. اين دو باكتري به عنوان باكتريه اي آغازگر ماست شناخته مي شوند. ويژگي هايي نظير اسيديته، ميزان اسيد چرب آزاد خواص حسي و تغذيه اي تحت تاثير تركيبات شيميايي شير، شرايط فرآيند، افزودن طعم دهنده ها و فعاليت باكتري هاي آغازگر در طي تخمير شير است. ما در این مقاله به بهينه سازي سه گانه شرايط تخمير شير در توليد ماست پروبيوتيك توسط لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس می‌پردازیم.
آنچه در این مطلب می‌خوانید:
پروبیوتیک چیست؟
يكي از ويژگي هاي محصولات لبني، فراهم كردن بستر مورد نياز براي رشد بسياري از ميكروارگانيسم ها است. از اين رو مي توان با افزودن يك يا چند باكتري مفيد به محصولات لبني، ارزش غذايي آنها را بالا برد. بخشي از اين ميكروارگانيسم ها كه مي توانند در شير و ماست رشد پيدا كنند باكتري هاي پروبيوتيك هستند. بنا به تعريف، پروبيوتيك عبارت است از ميكروارگانيسم هايي كه در پي مصرف خوراكي باعث بهبود خصوصيات ميكروفلور طبيعي دستگاه گوارش ميزبان مي شوند و اثرات مفيدي بر سلامت مصرف كننده به جا ميگذارد.
نقش پروبیوتیک ها
تاثير پروبيوتيك ها بر فلور ميكروبي دستگاه گوارش و ايفاي نقش درماني آن ها بستگي به مقدار مصرف روزانه اين باكتري ها دارد. بيشترين محدوده تعريف شده براي حضور باكتري هاي پروبيوتيك زنده از ۱۰ ۶تا CFU/ml 10 8 مي باشد. براي بدست آوردن ماست پروبيوتيك علاوه بر باكتري هاي آغازگر ماست، بايد باكتري پروبيوتيك در حين فرآيند تخمير و در محصول نهايي وجود داشته باشد. كشت آغازگر ماست مي تواند رشد پروبيوتيك ها را از طريق توليد مواد لازم براي رشد آنها تقويت كند.
لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس
يكي از انواع پروبيوتيك ها لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس مي باشد. ويژگي هاي باكتريهاي پروبيوتيك و محيط كشت مورد نياز آنها متفاوت است. بنابراين مي توان با تغييراتي در شرايط تخمير شير يا بهينه سازي اين فرآيند سعي در افزايش تعداد باكتري پروبيوتيك نمود و يا طول عمر آنها را در ماست افزايش داد.
ميزان ماده جامد كل شير
مشخص شده است كه افزايش در ميزان ماده جامد كل شير به ميزان ۵درصد باعث دو برابر شدن ويسكوزيته محصول مي شود. از طرفي ميزان ماده جامد كل در حقيقت معرف ميزان پروتئين يا اسيد آمينه هاي موجود در شير مي باشد كه در حين فرآيند تخمير به مصرف باكتري هاي آغازگر وپروبيوتيك ميرسد كه اين مطلب تاثيرگذاري ميزان SNF را بر روي تخمير شير نشان مي دهد.
تيمار حرارتي شير
تيمار حرارتي شير نيز يكي ديگر از فاكتورهايي است كه بر رشد ميكروارگانيسم ها در شير تاثير بسزايي دارد. بررسي هاي دقيق تر نشان داد كه تنها تفاوت ۱۵-۱۰درجه سانتي گراد در تيمار حرارتي شير مي تواند باعث رشد يا عدم رشد باكتري هاي آغازگر ماست در فرآيند تخمير شير شوند.
افزودن اسيد آسكوربيك به شير نيز توسط Dave و Shahبه منظور بررسي رشد باكتري هاي پروبيوتيك انجام شد كه نتايج آن اميدوار كننده نبود. تخمير دو مرحله اي نيز يكي ديگر از روشهايي است كه براي توليد و تكثير باكتري هاي پروبيوتيك در حين فرآيند تخمير شير بكار ميرود. روش كار بدين صورت است كه باكتري هاي پروبيوتيك را جداگانه به شير تلقيح كرده و پس از گذشت زمان يك يا دو ساعت باكتري هاي آغازگر را به آن اضافه مي كنند. اين كار سبب مي شود كه باكتري پروبيوتيك بتواند بهتر با محيط رشد خود هماهنگ شود.
در اين پژوهش براي اولين بار تاثير چهار فاكتور فوق بر رشد باكتري پروبيوتيك جهت بدست آوردن ماست پروبيوتيك بررسي شد. طرح آزمايش به روش تاگوچي و با هدف حداكثر رشد و بقاي باكتري لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس تعيين شد. نتايج حاصل از اين تحقيقات براي بدست آوردن ماست پروبيوتيكي با ارزش غذايي بالاتر سودمند خواهد بود.
روش انجام تحقیق
مـواد مـورد نـياز آزمون هاي شـيميايي اين پژوهـش و محيط كشت MRS متعلق به شركت مرك آلمان مي باشد. شيرخشك ( % ۰/۵چربي) از شركت لبن پارس قزوين خريداري شد.
كشت آغازگر ماست از نوع DVS و با نام تجاري x-11 از شركت كريستن هانسن دانمارك خريداري شد. اين كشت شامل دو باكتري آغازگر ماست به نسبت يكسان مي باشد. از اين كشت، يك كشت مادر تهيه شد. همچنين سوش پروبيوتيك اين پژوهش يعني لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس از مركز كلكسيون باكتري و قارچ هاي ايران با شماره شناسه PTTC 1643 بصورت آمپول ليوفليز شده خريداري گشت.
اين سوش را در زير هود ميكروبي و شرايط استريل به محيط كشت MRS براث اضافه كرده و اين مجموعه را در شرايط بي هوازي ۴۸تا ۷۲ ساعت در° ۳۷ C گرمخانه گذاري كرده و سپس از اين محيط كه حاوي باكتري هاي پروبيوتيك مي باشد بر روي پليت هاي حاوي MRS آگار كشت داده و بار ديگر پليت ها در ۳۷ درجه سانتيگراد گرمخانه گذاري شدند. بدين ترتيب باكتري پروبيوتيك از حالت منجمد خارج و بر روي پليت ها منتقل شده و براي مصارف بعدي در يخچال نگهداري مي شوند.
طرح آزمايش
در اين پژوهش چگونگي تاثير چهار فاكتور مستقل )تخمير دوگانه، ،SNF تيمار حرارتي و افزايش اسيد آسكوربيك) در سه سطح بر رشد و بقاي باكتري هاي پروبيوتيك در ماست پروبيوتيك مورد بررسي قرار گرفت. در صورتي كه تمام آزمايش هاي ممكن مورد بررسي قرار گيرد به ۸۱ آزمايش نياز خواهد بود. براي كاهش اين تعداد آزمايش به تعداد معقولي از آزمايشات، از طرح عامل كسري و روش آماري تاگوچي استفاده شد. با استفاده از جداول تاگوچي، ۹ تركيب متفاوت تعريف و در آرايه هاي متعامد ۹ گانه چيده شد. هر كدام از آرايه هاي جدول با رعايت اصل تصادفي براي آزمايشها مورد استفاده قرار گرفت و نتايج مربوط به آن اندازه گيري شد.
توليد ماست پروبيوتيك
براي توليد ماست پروبيوتيك، ۲پايه شامل سطوح مورد نظر براي هر آزمايش آماده شد. سپس هركدام از آزمايش ها مطابق دستور آزمايش انجام شد. براي مثال تيمار حرارتي آزمايش هاي ۴ ،۱و ۷در دماي ° ۸۵ Cو آزمايشهاي ۵ ،۲و ۸در دماي ۷۲°Cو آزمايش هاي ۶ ،۳و ۹در دماي ۶۲°Cانجام پذيرفت. موارد تخمير دو مرحله اي و اضافه كردن اسيد آسكوربيك نيز به طور مشابه انجام پذيرفت.
آزمون ميكروبي
هر آزمايش سه بار تكرار شد. براي شمارش ميكروبي تعداد باكتري هاي پروبيوتيك، از روش رقت هاي متوالي استفاده شد. بنابراين از ۱ mlاز نمونه، تا رقت ۱۰ -۸ CFU/mlرقت تهيه شد. از هركدام از اين رقت ها بر روي پليت ها و با استفاده از محيط MRS-bileكشت انجام شد. تعداد كلوني هاي بوجود آمده بعد از ۴۸ساعت گرمخانه گذاري در دماي ۳۷ °Cبر اساس استاندارد شماره ۷۷۱۴استاندارد ملي ايران شمارش شد كه نتايج آن براي روزهاي اول و بيستم مطابق جداول ۳و ۴مي باشد.
اندازه گيري pH
براي تعيين pH نمونه ها، از دستگاه pHمتر اسـتفاده شد. قبل از اين كار كاليبراسيون با استفاده از بافرهاي استاندارد (pH= 7و pH= 4) انجام پذيرفت. در اين تحقيق pH نمونه ها در روز اول و روز بيستم اندازه گيري شد.
آزمون ارزيابي حسي
براي ارزيابي حسي ماست پروبيوتيك بدست آمده از استاندارد شماره ۶۹۵ استاندارد ملي ايران استفاده شد. طبق اين استاندارد حداكثر امتياز حاصل شده ۵۰و حداقل آن صفر مي باشد.
بهينه سازي
همانطور كه اشاره شد برنامه آماري تاگوچي در آرايه ،l9 اساس طراحي آزمايشات و برنامه نرم افزاري Qualitek-4 نيز براي تحليل داده ها استفاده شد.
در صورتي كه شرايط بهينه بدست آمده از نرم افزار در آزمايش هاي ۹گانه انجام شده نباشد، مي بايست يك بار ديگر نمونه با شرايط پيشنهادي نرم افزار تهيه شود و سپس با شمارش باكتري هاي موجود در آن صحت و سقم شرايط بهينه بدست آمده بررسي شود. از آنجا كه سه هدف متفاوت مد نظر اين تحقيق بود، سه دفعه بهينه سازي انجام پذيرفت كه به ترتيب بررسي مي شود.
يافته های تحقیق
الف) هدف از اين بهينه سازي بدست آوردن بيشترين باكتري پروبيوتيك در ماست توليد شده در روز اول مي باشد. ميزان باكتري پيشنهاد شده توسط نرمافزار پساز بهينه سازي ۱/۸۸ × ۱۰۸ CFU/ml مي باشد كه پس از انجام آزمايش تاييدي مقدار ۱/۷۵ × ۱۰۸ CFU/mlبدست مي آيد كه درصد اختلاف تنها %۶مي باشد كه قابل اغماض است. در اين بهينه سازي مشخص شد كه تخمير دو مرحله اي بيشترين تاثير را دارا مي باشد.
ب) هدف از اين بهينه سازي بدست آوردن بيشترين باكتري پروبيوتيك در ماست توليد شده در روز بيستم مي باشد.
نتيجه بدست آمده حاكي از آن است كه براي شرايط بهينه، مي بايست از سطح دوم در فاكتور اول و از سطح دوم در فاكتور دوم و از سطح سوم در فاكتور سوم و از سطح دوم در فاكتور چهارم استفاده نمود. در ضمن مقدار بهينه سازي شده برابر ۱/۷ × ۱۰۷ CFU/mlاست.
با توجه به اينكه شرايط فوق در ميان آزمايش هاي انجام شده وجود نداشت، يك آزمايش ديگري بر اساس شرايط فوق انجام مي شود كه نتيجه آن ۱/۸ × ۱۰۷ اختلاف كمي با نتيجه بدست آمده از نرم افزار دارد و تنها در حدود ۵درصد داراي خطا مي باشد. تاثير افزودن اسيد آسكوربيك در زنده ماندن باكتري پروبيوتيك قابل توجه مي باشد كه با توجه به غير هوازي بودن اختياري باكتري لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس توجيه مي شود.
ج) هدف از بهينه سازي كلي اين است كه شرايطي بدست آورده مي شود كه در آن ماست بدست آمده داراي شرايط بهينه همزمان تعداد باكتري در ابتدا و انتها و همچنين بهترين ارزيابي حسي باشد. براي اين كار از نرم افزار به گونه اي استفاده مي شود كه چند پاسخ همزمان را بررسي كند. براي اين كار طبق دستور نرم افزار، براي هر كدام از پاسخ ها درصد اهميت و نوع پاسخ مشخص مي شود.
به دليل آنكه تعداد باكتري پروبيوتيك هدف اصلي اين پروژه مي باشد درصد اهميت بيشتري به تعداد باكتري اختصاص داده ميشود (%۵۰) درصد اهميت ارزيابي حسي و pHنيز يكسان در نظر گرفته شد (%۲۵).
بحث
همان طور كه مشاهده شد، در اين پروژه بهينه سازي سه بار و براي اهداف متفاوتي انجام شد. در بهينه سازي اول، هدف از بهينه سازي بدست آوردن تعداد بيشتري از باكتري پروبيوتيك در ابتداي توليد محصول بود كه نتايج آن حاكي از آن بود كه عنصر اصلي در اين بهينه سازي ترتيب تلقيح باكتري لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس در شير مي باشد و كم اثرترين فاكتور نيز دماي تيمار حرارتي مي باشد.
در بهينه سازي دوم هدف از بهينه سازي، تعداد باكتري زنده پروبيوتيك در روز آخر (بيستم) بود كه در اين بهينه سازي فاكتور اسيد اسكوربيك مهمترين تاثير را در مقدار بهينه دارا مي باشد. در سومين بهينه سازي كه يك بهينه سازي كلي بود، مقدار باكتري در ابتدا و انتها و همچنين شرايط شيميايي و فيزيكي بهينه سازي شد كه نتايج آن با دو بهينه سازي قبلي تفاوت داشت. در اين بهينه سازي اگرچه اسيد اسكوربيك موثرترين فاكتور شناخته شد اما تيمار حرارتي نيز داراي اهميت بسزايي در نتيجه نهايي مي باشد و برعكس مورد دوم، درصد ماده خشك كمترين تاثير را دارا مي باشد.
نتيجه گيري
از سه بهينه سازي فوق مي توان نتيجه گرفت كه براي آنكه بتوان ماستي توليد كرد كه داراي طعم و pH خوب و مناسبي باشد، بايد از افزايش تعداد باكتري صرف نظر كرد و در صورتي كه هدف دستيابي به ميزان بالاي باكتري باشد، مزه و طعم مناسب نخواهد بود براي ادامه كار و استفاده از نتايج اين تحقيق، پيشنهاد مي شود كه ضمن استفاده از ساير سوش‌هاي پروبيوتيك و بررسي بقا و ويژگي‌هاي محصول، از افزودني ديگري همانند قندها استفاده شود تا تاثيرات نامطلوب اسيد آسكوربيك را بر طعم بهبود ببخشد و علاوه برآن به عنوان يك ماده غذايي مناسب براي باكتري هاي پروبيوتيك به حساب آيد.
