شیر گاومیش، یک ضدمیکروب غافلگیر کننده!

باکتری های اسیدلاکتیک، فلور طبیعی دستگاه گوارش انسان و حیوانات به شمار میروند. در بسیاری از اکوسیستم های غذایی این باکتریها بخش اعظمی از میکروفلور غالب را تشکیل می دهند و ممکن است به صورت کشت کمکی و یا استارتر به محصولات غذایی نیز اضافه شوند. همچنین باکتری های اسیدلاکتیک علیه عوامل مختلف بیماری زا یا غیر بیماری زا، طیف وسیعی از ترکیبات ضد میکروبی را تولید می کنند و لذا این قابلیت را دارند که برای مقابله با این نوع از عوامل میکروبی استفاده شوند. ما در این مقاله به ارزیابی اثرات ضدمیکروبی باکتری لاکتوباسیلوس سالیواریوس جداسازی و شناسایی شده از شیر گاومیش می‌پردازیم.

عملکرد ضد میکروبی باکتری‌ها

در شرایط خاصی، بسیاری از باکتریهای اسیدلاکتیک توانایی تولید اگزوپلی ساکارید را نیز دارند. ترکیبی که در مقاومت میکروارگانیسم در مقابل فاژها، حملات انگل ها و نیز تشکیل بیوفیلم اهمیت بسزایی داشته و موجب افزایش مقاومت باکتری می شود. تولید اسیدلاکتیک از سوی این باکتری ها و در نتیجه کاهش   pH محیط از جمله عواملی است که منجر به عملکرد ضدمیکروبی آنها می شود. همچنین تولید ترکیبات ضدمیکروبی متنوع که در دو دسته ترکیبات با وزن مولکولی پایین (پراکسید هیدروژن، دیاکسیدکربن و دیاستیل) و وزن مولکولی بالا (نظیر باکتریوسین ها) قرار می گیرند، از ویژگی های بارز این باکتری ها است. از سالها پیش رابطۀ بین باکتریهای اسیدلاکتیک و سلامت انسان مشخص شده است. خصوصیات سلامتی بیشمار باکتری های اسیدلاکتیک باعث شده است که این دسته به عنوان کاندیدای مناسبی برای میکروارگانیسم پروبیوتیک مطرح شوند.

باکتری لاکتوباسیلوس سالیواریوس

لاکتوباسیلوس ها، باکتری های گرم مثبت میله ای شکل متعلق به باکتری های اسیدلاکتیک هستند. این جنس بیشترین تنوع بین گونه ای را دارند و بالغ بر  ۱۵۲گونۀ مختلف هستند. این باکتریها در موادی با میزان کربوهیدرات بالا زیست می کنند و از مخاط دهان، روده و واژن انسان و حیوانات تا گیاهان و محصولات غذایی مختلف جداسازی و شناسایی شده اند. لاکتوباسلوس ها نقش مهمی در تولید محصولات تخمیری سبزی، گوشت و محصولات لبنی دارند.

در محصولات لبنی و دیگر محصولات تخمیری، لاکتوباسیلوس ها مسئول برخی ویژگی ها از جمله تولید اسیدلاکتیک، کاهش میزان لاکتوز، بهبود خصوصیات حسی، فیزیکی و شیمیایی و کنترل عوامل بیماریزا هستند. لذا از گونه های مختلف این جنس به عنوان استارتر و یا پروبیوتیک استفاده می شود و تلاش های زیادی برای جداسازی گونه های جدید این باکتری در حال انجام است.

لاکتوباسیلوس سالیواریوس همچون بسیاری از گونه های لاکتوباسیلوس، به دلیل خصوصیات ویژه، به عنوان یک باکتری پروبیوتیک مطرح است. از ویژگی های پروبیوتیک این باکتری می توان به ایجاد تعادل میکروبی در روده، تولید ترکیبات ضدمیکروب، تحریک سیستم ایمنی، مهار فعالیت آنزیمی مدفوع، تولید اسیدهای چرب کوتاه زنجیر اشاره کرد. این باکتری به دلیل تولید باکتریوسین های زیر کلاس    IIa, IIb, Iidبه عنوان یک پروبیوتیک شاخص مطرح است.

تلاش برای جداسازی باکتری های

تاکنون مطالعات مختلفی برای جداسازی لاکتوباسیلوس سالیواریوس از منابع مختلف از جمله مدفوع نوزاد شیرخوار، گوشت عمل آوری شدۀ خوک و مدفوع مرغ انجام شده است که نتیجۀ این تحقیقات جداسازی سویه های مختلف با ویژگی های عملکردی متفاوت است. در برخی نمونه ها از جمله لاکتوباسیلوس سالیواریوس CECTجداشده از مدفوع نوزاد شیرخوار باکتری به عنوان پروبیوتیک شناخته شده در سطح دنیا بهره برداری می شود. تلاش به منظور جداسازی باکتری های اسیدلاکتیک با خصوصیات منحصربه فرد از شیر و محصولات تخمیری برای استفاده در غذاهای عملگرا (Functional food) از اهمیت ویژه ای برخوردار است.

تاکنون از منابع مختلف برای جداسازی، شناسایی و عرضۀ جدایه های جدید با خصوصیات عملکردی مناسب استفاده شده که نتیجۀ آن دستیابی به سویه های جدید و استفاده از آنها در صنایع مختلف بوده است. با این وجود، محققان همچنان درصدد جداسازی و شناسایی جدایه های جدید با خصوصیات عملکردی منحصربه فرد هستند. تنوع باکتری های اسید لاکتیک در محصولات غذایی مختلف و در شرایط جغرافیایی مختلف متفاوت است.

چرا شیر گاومیش؟

این تنوع در محصولات لبنی تولید و عرضه شده در دنیا از جمله شیر گاومیش که تولید و مصرف آن محدودۀ جغرافیایی خاصی را در بر می گیرد نیز بسیار پیچیده و متنوع است و می تواند انگیزهای برای غربالگری این محصولات با هدف دستیابی به سویه های مناسب با خصوصیات عملکردی و تکنولوژیک ویژه باشد. با وجود انجام مطالعاتی دربارۀ ویژگی های باکتریهای اسیدلاکتیک در محصولات لبنی شیر گاومیش مطالعۀ جامعی در زمینۀ تنوع، گونه های غالب و حضور باکتری لاکتوباسیلوس سالیواریوس در شیر گاومیش صورت نپذیرفته است. هدف از این مطالعه، جداسازی و شناسایی فنوتیپی و مولکولی لاکتوباسیلوس سالیواریوس از شیر خام گاومیش و ارزیابی برخی اثرات پروبیوتیکی آن از جمله اثرات ضدمیکروبی و باکتریوسینوژنیک بر علیه سالمونلا تیفیموریوم، اشریشیا کلی، لیستریا مونوسیتوژنز و استافیلوکوکوس اورئوس و هیدروفوبیسیتی سطحی باکتری در شرایط آزمایشگاهی است.

مواد و روش های تحقیق

نمونه برداری شیر خام گاومیش و شناسایی فنوتیپی جدایه های لاکتوباسیلوس تعداد  ۲۰نمونه شیر خام گاومیش از دامدارهای سنتی و صنعتی شهرستان ارومیه در  ۶ماه اول سال  ۱۳۹۴جمع آوری شد.

و سریعاً در داخل بطری های استریل در شرایط سرد به آزمایشگاه میکروبیولوژی موادغذایی دانشکدۀ دامپزشکی دانشگاه ارومیه منتقل شدند. برای جداسازی اولیه، ابتدا یک میلیلیتر از هر نمونه شیر، به  ۱۰میلیلیتر محیط   MRSبراث (  deMan, Rogosa and Sharpe) شرکت کیولب، (کانادا) اضافه شد و هر نمونه در شرایط بی هوازی در جار و با استفاده از گاز پک نوع   Cدر دمای ۳۷˚C به مدت ۴۸ـ ۲۴ساعت انکوبه شد. سپس از هر نوع نمونه با آنس روی محیط   MRSآگار کشت خطی داده و پلیت ها در دمای  ۳۷˚Cبه مدت ۴۸ـ ۲۴ساعت گرمخانه گذاری شدند.

پس از آن حداکثر تعداد  ۵کلنی تکی متفاوت بهصورت تصادفی از هر نمونه انتخاب شد و ابتدا تست کاتالاز و سپس رنگ آمیزی گرم و بررسی شکل با استفاده از میکروسکوپ نوری انجام پذیرفت. کلنی هایی که به شکل گرد و محدب با لبۀ یکدست، رنگ سفید اپک و موکوئید، گرم مثبت و کاتالاز منفی بودند، برای انجام آزمایشات مولکولی انتخاب شدند.

شناسایی مولکولی

برای شناسایی جدایه های لاکتوباسیلوس به روش مولکولی، ابتدا   DNAژنومی از جدایه های انتخاب شده با استفاده از روش توصیف شده از سوی   Aljanabiو ۱۹۹۷ Martinezاستخراج شد. قطعه ای از ژن  ۱۶S rRNA به اندازۀ  ۱۵۴۰ جفت باز با استفاده از جفت پرایمر توصیف شده از سوی   Scarpelliniو همکاران (۲۰۰۲) شامل پرایمر رفت ( )EGE1و برگشت ()EGE2 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’  به ترتیب با توالی های  تکثیرPCR   به روش۵’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’ و شد. واکنش   PCRدر حجم  ۲۵میکرولیتر شامل ۲/۵ میکرولیتر بافر   PCRبا غلظت  ۱۰برابر، پرایمر رفت و برگشت با غلظت  ۲۵میکرومولار هر کدام  ۰/۵میکرولیتر، یک میکرولیتر کلراید منیزیم  ۵۰ میلیمولار، چهار میکرولیتر   dNTPsبا غلظت  وTaq DNA Polymerase   واحد آنزیم۲/۵ ، میلیمولا ر۱/۲۵ مقدار  ۵میکرولیتر   DNAاستخراج شده، انجام گرفت. واکنش  PCRبا استفاده از ترموسایکلر با برنامۀ دمایی عرضه شده از سوی   Scarpelliniو همکاران انجام گرفت.

در ادامه قطعۀ تکثیر شده با استفاده از آنزیم  HinfI هضم آنزیمی شد و به منظور شناسایی گونه، الگوی هضم آنزیمی محصول  PCRجدایه های مختلف با الگوی هضم آنزیمی جدایه های گزارش شده در بانک ژن مقایسه شد. همچنین برای تأیید نتایج هضم آنزیمی از هر جدایه با الگوی متفاوت هضمی، یک نمونه محصول  PCR برای تعیین توالی به شرکت سینا کلون ارسال شد. لازم به ذکر است که نتایج تعیین توالی بیان نشده است.

ارزیابی ویژگی های ضدمیکروبی لاکتوباسیلوس سالیواریوس

تهیه و آماده سازی باکتری ها

در این مطالعه، باکتری های سالمونلا تیفیموریوم  ،ATCC1730اشریشیا کلی  ،ATCC 11303لیستریا مونوسیتوژنز  ،ATCC 19115 استافیلوکوکوس اورئوس   ATCC 25923به عنوان عوامل بیماریزا و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس  LA5 به عنوان کنترل استفاده شدند. این باکتریها از کلکسیون میکروبی گروه بهداشت موادغذایی دانشکدۀ دامپزشکی دانشگاه ارومیه تهیه شدند. برای نگهداری باکتریها در دمای  -۱۸˚Cو تهیۀ سوسپانسیون آنها از محیط کشت لوریا برتانی و   MRS استفاده شد. برای به دست آوردن تعداد باکتری در هر میلیلیتر، از روش تعیین جذب نوری در طول موج  ۶۰۰نانومتر به وسیلۀ اسپکتوفتومتر و کشت باکتری استفاده شد.

بررسی فعالیت ضدمیکروبی لاکتوباسیلوس سالیواریوس

ویژگی های ضدمیکروبی لاکتوباسیلوس سالیواریوس به روش نقطه ای و کشت دولایه انجام گرفت. برای این منظور مقدار  ۱۰میکرولیتر از سوسپانسیون  ۱۸ساعته جدایه لاکتوباسیلوس سالیواریوس روی  MRSآگار ریخته شد و پلیت ها به مدت ۲۴ ساعت در دمای  ۳۷˚Cنگهداری شدند. سپس  ۷میلیلیتر محیط لوریا برتانی نیمه جامد حاوی تعداد استاندارد ( ۱/۵×۱۰۶باکتری در هر میلیلیتر) از هریک از باکتریهای بیماریزای بررسی شده (لیستری ا مونوسیتوژنز، سالمونلاتیفی موریوم، اشریشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس) در فاز ایستایی به صورت لایۀ دوم به پلیت اضافه شد و پس از  ۲۴ساعت گرمخانهگذاری، ناحیۀ مهاری تشکیل شده بررسی و با کولیس اندازهگیری شد. در این آزمایش از باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس   LA5به عنوان نمونۀ شاهد برای مقایسه با لاکتوباسیلوس سالیواریوس استفاده شد.

بررسی تولید باکتریوسین لاکتوباسیلوس سالیواریوس پس از تأیید خواص ضدمیکروبی جدایۀ لاکتوباسیلوس سالیواریوس

برای تهیۀ مایع رویی حاصل از کشت باکتری ( Cell free  ،)supernatantدر محیط  MRSبرای باکتری کشت داده شد و به مدت  ۲۴ساعت در دمای  ۳۵˚Cدر انکوباتور شیکردار از آن نگهداری به عمل آمد. سپس سوسپانسیون باکتریایی به مدت ۱۰ دقیقه در دمای  ۲˚Cبا سرعت  ۶۰۰۰دور در دقیقه سانتریفوژ شد.

برای از بین بردن اثر اسیدلاکتیک و پراکسید هیدروژن احتمالی تولیدشده از سوی باکتری، بهترتیب  pHمایع رویی به دست آمده از کشت باکتری با استفاده از سود  ۰/۱نرمال در عدد  ۷تنظیم شد و در ادامه آنزیم کاتالاز (دو میلیگرم در لیتر) به آن اضافه شد. پس از انجام تیمار، مایع رویی با استفاده از فیلتر  ۰/۲۲میکرونی، فیلتر و خصوصیت تولید باکتریوسین بررسی شد. بدین منظور، دیسک های کاغذی به قطر  ۶میلیمتر در مایع رویی به مدت  ۵ دقیقه غوطه ور شدند و پس از خشکشدن در دمای  ،۳۷˚Cروی سطح پلیت کشت داده شده با باکتریهای بیماری زای منتخب قرار گرفتند. پس از ۲۴ساعت گرمخانه گذاری در دمای  ،۳۷ ˚Cناحیۀ مهاری تشکیل شده بررسی و با استفاده از کولیس اندازه گیری شد.

سنجش هیدروفوبیستی باکتری

برای سنجش هیدروفوبیستی سطحی باکتری، از آزمون اتصال باکتری به هیدروکربن گزیلن و تولئن استفاده شد. ابتدا سوسپانسیون باکتریایی با جذب نوری  ۰/۰۸تا  ۰/۱در طول موج ۶۴۰نانومتر تهیه (جذب نوری اولیه) و سپس به  ۰/۵میلیلیتر از هریک از هیدروکربن ها،  ۳میلیلیتر از سوسپانسیون اضافه شد.

پس از هم زدن بهمدت دو دقیقه، سوسپانسیون بهمدت  ۱۵دقیقه در یک محل ثابت قرار گرفت. پس از این زمان جذب نوری فاز آبی در طول موج  ۶۴۰نانومتر ثبت (جذب ثانویه) و درصد سلول های متصل به هیدروکربن با استفاده از فرمول محاسبه شد.

در این آزمایش باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس   LA5به عنوان نمونۀ شاهد برای مقایسه با لاکتوباسیلوس سالیواریوس بررسی شد.

روش آماری

داده های به دست آمده در این تحقیق با استفاده از آنالیز واریانس یکطرفه و تست تعقیبی دانکن در برنامۀ  SPSS نسخۀ )IBM corp., NY, USA( 22در سطح معنیدار  P > 0/05 آنالیز GraphPad (San Diego California USA) شدند.

برای رسم منحنی از نرم افزار استفاده شد. تمامی تست های میکروبی و هیدروفوبیسیتی حداقل در سه تکرار انجام گرفتند.

یافته ها

شناسایی مولکولی باکتریهای اسیدلاکتیک از تعداد  ۶۰کلنی مشکوک به جنس لاکتوباسیلوس، در بررسی مولکولی و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، برای ۲۳ جدایه قطعه ای به طول حدود  ۱۵۴۰جفت باز تکثیر شد.

که به عنوان جنس لاکتوباسیلوس شناسایی شدند. ۲۳ لاکتوباسیلوس شناسایی شده برای شناسایی گونه، تحت ارزیابی های مولکولی شامل هضم آنزیمی و تعیین توالی نوکلئوتیدی قرار گرفتند. با استفاده از آنزیم  HinfI قطعات تکثیرشده برش داده شدند. الگوهای هضم آنزیمی متفاوتی برای جدایه های مختلف به دست آمد. به طور کلی از تعداد  ۲۳جدایۀ بررسیشده به روش هضم آنزیمی،  ۸الگوی هضم آنزیمی متفاوت که تحت عنوان الگوهای  P1الی   P8نامگذاری شدند، به دست آمد.

الگوهای هضمی متفاوت حاکی از وجود گونه های مختلف بود. هرچند الگوهای هضم آنزیمی به دست آمده روشی مناسب برای تفکیک گونه های باکتریایی است ولی به منظور ارزیابی دقیقتر، از هر الگوی هضم آنزیمی متفاوت یک نمونه تعیین توالی شد.

نتایج تعیین توالی جدایه ها با الگوهای هضم آنزیمی متفاوت در شکل  ۲نشان داد انتروکوکوس فاسیوم و لاکتوباسیلوس سالیواریوس گونه های غالب بودند. در بین جدایه های لاکتوباسیلوس، یک جدایه مربوط به لاکتوباسیلوس سالیواریوس گزارش شد. فعالیت ضدمیکروبی لاکتوباسیلوس سالیواریوس توانایی مهار رشد جدایۀ لاکتوباسیلوس سالیواریوس و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس  LA5روی باکتری های بیماری زا که به صورت هالۀ ممانعت از رشد بیان می شود.

نتایج آزمون ضدمیکروبی نشان داد که لاکتوباسیلوس سالیواریوس اثر مهاری روی باکتریهای لیستریا مونوسیتوژنز، اشریشیاکلی، سالمونلا تیفیموریوم و استافیلوکوکوس اورئوس دارد و به ترتیب هالۀ ممانعت از رشدی به قطر ۴۰/۵۵ ،۴۲/۷۲ ،۴۸/۳۷ و  ۴۹/۲۷میلیمتر ایجاد کرد که اختلاف معنیداری () P > 0/05 با باکتری استاندارد لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس   LA-5داشت.

اثرات مهاری مایع رویی جدایۀ لاکتوباسیلوس سالیواریوس روی باکتریهای بیماریزا که به صورت هالۀ ممانعت از رشد است. هیدروفوبیستی لاکتوباسیلوس سالیواریوس هیدروفوبیستی سطحی لاکتوباسیلوس سالیواریوس با استفاده از اتصال به گزیلن و تولئن آورده شده است. هیدروفوبیستی لاکتوباسیلوس سالیواریوس به گزیلین و تولئین به ترتیب  ۵۵/۶و  ۵۵/۳درصد گزارش شد که حاکی از هیدروفوبیستی متوسط و مناسب جدایه بود.

بحث و نتیجه گیری

باتوجه به اینکه جزئیات کاملی در زمینۀ جداسازی باکتری های اسیدلاکتیک از شیر خام گاومیش وجود ندارد، بنابراین مطالعات و بررسی برای شناسایی باکتری های اسیدلاکتیک از شیرخام گاومیش انجام شد.

مرحلۀ اول بررسی فنوتیپ باکتری های اسیدلاکتیک با استفاده از روشهای کلاسیک و مرحلۀ دوم استفاده از روش های مولکولی بود.

در هر مرحله مشخص شد که تعداد جدایه های کوکسی بیشتر از باسیل بود. تنوع باکتریهای اسیدلاکتیک در محصولات غذایی مختلف و در شرایط جغرافیایی گوناگون زیاد است. این تنوع در محصولات لبنی تولید و عرضه شده در دنیا نیز بسیار پیچیده و بالا است که می تواند انگیزهای برای غربالگری این محصولات با هدف  دستیابی به سویه های مناسب با خصوصیات عملکردی و تکنولوژیک ویژه باشد.

در بررسی نمونه های شیر تخمیری گاو، گوسفند، گاو کوهاندار و مادیان در کشور مغولستان، لاکتوباسیلوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس هلوتیکوس، بهعنوان باکتریهای اسیدلاکتیک غالب گزارش شدند. در مطالعه ای که در سال  ۲۰۱۶ روی باکتری های اسیدلاکتیک شیر گاومیش در کشور اندونزی انجام گرفت، نشان داده شد که غالب جدایه ها مربوط به لاکتوباسیلوس برویس، لاکتوباسیلوس پاراکازئی، لاکتوباسیلوس پنتوسوس، لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوکوکوس لاکتیس هستند.

در مطالعۀ  Messaoudi و همکاران (۲۰۱۱) به منظور جداسازی باکتریهای اسیدلاکتیک از مدفوع مرغ، اکثریت جدایه ها متعلق به جنس لاکتوباسیلوس بود. لاکتوباسیلوس سالیواریوس، ۱۹/۴درصد کل باسیلوس های جداشده را به خود اختصاص داد. سه سویۀ مختلف لاکتوباسیلوس سالیواریوس ( ,SMXD51  )MMS122, MMS151اثرات ضدمیکروب چشمگیری بر کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کلی داشت. این ویژگی به دلیل تولید باکتریسوین از سوی این سویه ها گزارش شد.

نتایج بررسی  Aziz و همکاران (۲۰۰۹) روی باکتری های اسیدلاکتیک در شیر گاو نشان داد که از مجموع  ۲۷جدایۀ رشدیافته در محیط  ،MRSبا استفاده از شناسایی بیوشیمیایی، فقط  ۵باکتری اسیدلاکتیک شامل لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، لاکتوباسیلوس دلبروکی تحت گونۀ بولگاریکوس، لاکتوکوکوس لاکتیس تحت گونۀ کرموریس، لاکتوکوکوس لاکتیس تحت گونۀ لاکتیس و استرپتوکوکوس ترموفیلوس وجود دارند. لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، باکتری اسیدلاکتیک غالب در شیر گاومیش گزارش شد. این در حالی بود که در شیر گاو و گوسفند به ترتیب استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوکوکوس لاکتیس تحت گونۀ لاکتیس، گونه های غالب بودند.

مطالعات این محققان نشان داد که به دلیل تنوع بالای باکتریهای اسیدلاکتیک در شیر گاومیش، باکتری اسیدلاکتیک شیر این حیوان، مناسب برای استفاده به عنوان استارتر در کره است. در این مطالعه خصوصیات عملکردی و تکنولوژیک جدایه های باکتری های اسیدلاکتیک بررسی نشد. بررسی های مولکولی در مطالعۀ حاضر نشان داد از تعداد کل باکتریهای اسیدلاکتیک کوکوسی، حدود  ۹۷درصد انتروکوکوس فاسیوم و حدود  ۳درصد انتروکوکوس کازئیفلاووس بودند.  Martinو همکاران (۲۰۰۶) برای اولین بار لاکتوباسیلوس سالیواریوس  CECTرا از مدفوع نوزاد شیرخوار جداسازی و به روش مولکولی تشخیص دادند. این جدایه ویژگی های ضدمیکروبی مناسبی روی باکتریهای بیماریزای مطالعه شده نشان داد و روند بقای ایده آل در شرایط دستگاه گوارشی را نیز از خود نشان داد. نتایج این مطالعه مشخص کرد که علت خاصیت ضدمیکروبی این جدایه به دلیل تولید لاکتات، استات و پراکسید هیدروژن است.

توانایی در مهار رشد باکتری های فسادزا و بیماریزا از مهم ترین ویژگی های باکتری های اسیدلاکتیک به شمار میرود و به عنوان یکی از معیارهای پیشنهادی در بررسی خصوصیات یک باکتری پروبیوتیک مطرح است. اگر باکتری چنین توانایی در محافظت از میزبان در مقابل اجرام بیماری زا داشته باشد، می تواند به عنوان باکتری پروبیوتیک مناسب مطرح شود و در ادامه لازم است تست های تعیین خصوصیت پروبیوتیکی از جمله توانایی تحمل شرایط دستگاه گوارش، بیماریزا نبودن، کلونیزه شدن در مخاط دستگاه گوارش و رقابت و حذف عوامل بیماریزا انجام پذیرد.

نتایج این مطالعه نشان داد که لاکتوباسیلوس سالیواریوس جداشده در این مطالعه اثرات ضدمیکروبی منحصربه فردی دارد؛ به طوری که در مقایسه با لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس  ،LA-5اثرات ضدمیکروبی معنی داری نشان داد.

بیشترین اثر ضدمیکروبی جدایۀ لاکتوباسیلوس سالیواریوس به ترتیب در استافیلوکوکوس آرئوس ( ۴۹/۲۷ میلیمتر)، لیستریامنوسیتوژنز ( ۴۸/۳۷میلیمتر) اشریشیاکلی ( ۴۲/۷۲میلی- متر) و سالمونلاتیفیموریوم ( ۴۰/۵۵میلیمتر) دیده شد. این اثرات دربارۀ لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به ترتیب ،۳۹/۴۹ ،۳۳/۶۰  ۳۷/۳۷و  ۴۲/۶۵میلیمتر بود. در مجموع باکتریهای گرم مثبت در مقایسه با گرم منفی ها، حساسیت بیشتری نسبت به جدایۀ لاکتوباسیلوس سالیواریوس نشان دادند. در مطالعۀ   Iranmaneshو همکاران (۲۰۱۲) پیرامون ویژگی های ضدمیکروبی باکتری های اسیدلاکتیک جداشده از شیر و ماست، نشان داده شد که از مجموع  ۱۶۸جدایۀ جداشده از محیط  ،MRSفقط  ۷۷درصد جزو باکتریهای اسیدلاکتیک بودند و از این تعداد  ۳۳ جدایه خواص ضدمیکروبی بر علیه برخی عوامل بیماریزا از جمله لیستریا منوسیتوژنز، استافیلوکوکوس آرئوس و سالمونلا انترتیدیس داشتند.

Karami و همکاران (۲۰۱۷) اثرات ضدمیکروبی جدایه های لاکتوباسیلوس جداشده از نمونه های لبنی شامل شیر گاو، شیر گاومیش، پنیر و ماست علیه استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سوبتیلیس و سودوموناس آئروژینوزا را بررسی کردند.

نتایج نشان داد سه جدایۀ لاکتوباسیلوس آلیمانتاریوس، لاکتوباسیلوس ساکای و لاکتوباسیلوس کلونوایدس اثرات ضدمیکروبی متوسط (هالۀ ممانعت کمتر از  ۱۵میلیمتر) و قوی (هالۀ ممانعت از رشد بالای  ۱۵میلیمتر) داشتند.  Mercan  و همکاران (۲۰۱۵) اثرات ضدمیکروبی ۴ جدایۀ لاکتوباسیلوس سالیواریوس جداشده از مدفوع مرغ را بر علیه باکتری های گرم مثبت (استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سرئوس) و منفی (اشریشیاکلی، سالمونلا تیفیموریوم و یرسینیا انتروکولیتیکا) بررسی کردند. نتایج مطالعۀ آنها نشان داد که هر  ۴ جدایه، توانایی مهار رشد هر دو دسته باکتری های گرم مثبت (به استثناء باسیلوس سرئوس) و منفی را داشتند. این محققان، ویژگی های ضدمیکروبی مشاهده شده را به تولید باکتریوسین و ترکیبات شبه باکتریوسین نسبت دادند.

در مطالعه ای تنوع باکتری های اسیدلاکتیک دانه کفیر استفاده شده در کشور برزیل با هدف جداسازی جدایۀ لاکتوباسیلوس با خصوصیت پروبیوتیک انجام پذیرفت.  ۱۰۸جدایۀ جداشده به روش مولکولی و برش  DNA ریبوزومی و سکانس ژن ۱۶S rRNA تعیین گونه شدند که در مجموع در  ۱۱جنس شامل لاکتوکوکوس، لوکونستوک، لاکتوباسیلوس و اُاِنکوکوس قرار گرفتند. در   ۵۲جدایۀ لاکتوباسیلوس تست مقاومت به اسید معده، نمک های صفراوی، بررسی خصوصیات ضدمیکروبی و مقاومت به آنتیبیوتیک انجام پذیرفت که نتایج وجود ویژگی پروبیوتیکی مناسب در سه گونه را نشان داد.

مطالعات مختلفی دربارۀ بررسی ویژگی های ضد میکروبی باکتری های اسیدلاکتیک صورت گرفته که در برخی از آنها علت اصلی این خصوصیت، تولید پراکسید هیدروژن و اسیدهای آلی گزارش شده است؛ ویژگی ای که متأثر از نوع و جنس گونه است. یکی از دلایل مهم ویژگی ضد میکروبی باکتریهای اسیدلاکتیک مربوط به تولید ترکیبات شبه باکتریوسین است. باکتریوسین ها، پپتیدهای سنتز شده از سوی ریبوزوم ها هستند که از قدرت ضد میکروبی بالایی برخوردارند. طیف وسیعی از باکتری ها از جمله باکتریهای اسیدلاکتیک قادر به تولید آنها هستند.

در این مطالعه برای اینکه مشخص شود خصوصیات ضد میکروبی باکتری مربوط به کدام ترکیب باکتری است، مایع رویی باکتری تهیه و سپس به ترتیب برای حذف اثرات   pH و پراکسید هیدروژن موجود در مایع رویی از سود (رساندن  pH به میزان خنثی) و کاتالاز استفاده شد. در نتیجه، عمده ترکیب ضد میکروب موجود در مایع رویی، ترکیبات شبه باکتریوسین تصور میشود. نتایج مطالعۀ حاضر نشان داد که بخشی از اثرات ضدمیکروبی جدایۀ لاکتوباسیلوس مربوط به ترکیبات شبه باکتریوسین است، چرا که مایع رویی تمیارشده با سود و کاتالاز، اثرات ضدمیکروبی نشان داد. بیشترین اثر ضدمیکروبی پالیده بر علیه باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس آرئوس با قطر هاله ممانعت از رشد  ۱/۳میلیمتر بود و کمترین اثر ضدمیکروب هم مربوط به باکتری اشریشیا کلی (قطر هاله ممانعت  ۰/۵میلیمتر) می شد.

به طور کلی، فعالیت ضدمیکروبی باکتریوسین ها علیه میکروارگانیسمی است که ارتباط نزدیکی با میکروارگانیسم تولیدکنندۀ آن دارد. در بررسی انجام شده روی  ۵۴ نمونه شیر در ایران،  ۱۹۸جدایۀ مختلف باکتری اسیدلاکتیک به روش فنوتیپی جداسازی و شناسایی شد. همۀ جدایه ها تقریباً اثر ضدمیکروبی بر علیه اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس آرئوس نشان دادند. نتایج این مطالعه نشان داد که این خاصیت ضدمیکروبی بیشتر مربوط به تولید اسید آلی از سوی این باکتریها است و پراکسید هیدرون نقشی ندارد. همچنین ثابت شد که اثر ضدمیکروبی  ۴جدایۀ تحت مطالعه روی استافیلوکوکوس آرئوس مرتبط با تولید مواد مهاری شبه باکتریوسین است.   Marques و همکاران (۲۰۱۷) اثرات مواد شبه باکتریوسین لاکتوباسیلوس کورواتوس  P99 را بر لیستریا منوسیتوژنز در محیط آزمایشگاهی و پنیر پراتو بررسی کردند.

حداقل غلظت بازدارندگی و کشندگی مایع رویی حاوی مواد شبه باکتریوسین بر علیه باکتری به ترتیب  ۱۵/۶و  ۶۲/ ۵میکروگرم بر میلیلیتر گزارش شد. این مایع باعث کنترل رشد لیستریا منوسیتوژنز در پنیر شد. یکی از معیارهای باکتری های پروبیوتیک، مرتبط با توانایی باکترسی در کلونیزه شدن در دستگاه گوارش انسان و حیوان است. عوامل مختلفی در این اتصال مؤثر هستند که یکی از آنها هیدروفوبیستی سطح باکتری است. هرچقدر باکتری هیدروفوب باشد، توانایی بیشتری در اتصال به سطوح دارد. هیدروفوبیستی سطحی باکتری، متأثر از محتوای غشاء سیتوپلاسمی باکتری است.

باکتریهایی با قدرت هیدروفوبی بالا، کاندیداهای مناسبی برای استفاده بهعنوان پروبیوتیک هستند. هیدروفوبیستی لاکتوباسیلوس سالیواریوس به گزیلین و تولئین بهترتیب  ۵۵/۶و  ۵۵/۳درصد گزارش شد. این در حالی بود که این مقدار برای لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس  ۶۵/۶ ، LA-5و  ۷۴/۶درصد بود. هر دو هیدروکربن آبگریز هستند و روی فاز آبی، یک فاز آلی تشکیل می دهند.

در بررسی انجام شده دربارۀ هیدروفوبیستی باکتریهای اسیدلاکتیک جداشده در حضور گزیلن، نتایج نشان داد که دو گونه از فعالیت هیدروفوبی بالا ( ۴۸و  ۵۲درصد) در مقایسه با سویه استاندارد ( ۳۷درصد) برخوردار بودند.

نتایج

نتایج مطالعۀ حاضر نشان داد که هیدروفوبیسیتی سطحی جدایۀ لاکتوباسیلوس، اختلاف معنیداری با باکتری استاندارد ندارد.

از آنجا که جداسازی و غربال میکروارگانیسم ها از منابع طبیعی، روشی مؤثر برای به دست آوردن سویه های مفید با خصوصیات ژنتیکی ثابت و استفاده از آنها در محصولات صنعتی است، لذا این مطالعه با هدف بررسی امکان شناسایی لاکتوباسیلوس سالیواریوس به عنوان باکتری پروبیوتیک بالقوه انجام شد. نتایج این مطالعه نشان داد که فراوانی لاکتوباسیلوس به عنوان یکی از جنس های مهم باکتری های اسیدلاکتیک در شیر خام گاومیش بسیار پایین است و به نظر میرسد، دیگر جنس ها از فراوانی بیشتری در این شیر برخوردار باشند.

لاکتوباسیلوس سالیواریوس جداشده از شیر گاومیش در این مطالعه اثرات ضدمیکروبی منحصربه فردی در مقایسه با لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس  LA-5نشان داد. مطالعات همچنین نشان داد که بخشی از این خصوصیت مربوط به ترکیبات شبه باکتریوسین است. که این نیاز به مطالعات تکمیلی دارد. با انجام دیگر آزمون های مرسوم و استاندارد بررسی خصوصیات پروبیوتیک در جدایه، می توان از جدایۀ فعلی به عنوان یک پروبیوتیک جدید در صنایع مختلف از جمله صنایع لبنی استفاده کرد.

منبع این مقاله این مقاله، مجله میکروبشناسی پزشکی ایران است. با تشکر ویژه  از  گروه بیوتکنولوژی میکروبی، دانشکدۀ علوم پایه، دانشگاه پیام نور واحد تهران شرق و گروه بهداشت و کنترل کیفی موادغذایی، دانشکدۀ دامپزشکی، دانشگاه ارومیه.

مطالب مرتبط: