راهکار موثر و تضمینی تشخیص تقلب در پنیرهاي گوسفندي

شناسایی شیر گونه حیوانی بکار رفته در محصولات لبنـی از جمله مسائل مهم در مورد ارزیابی ارزش ترکیبات غذایی و تهیه اطلاعات دقیق بـراي مصـرف کننـده اسـت. مراقبـت و نظارت بر تقلب شیر گاو در پنیرهاي گوسفندي و عدم تعـویض و جـایگزینی محصـولات گونـه هـاي مختلف و یا مخلوط کردن آنها با هم از جنبه هـاي مختلـف مذهبی، سلامت عمومی، اجتمـاعی و قـوانین دولتـی بسـیار مهم تلقی می شود. از جنبه سلامت عمومی می توان به ایجاد واکنش هاي آلرژيزا به بعضی پروتئین هاي حیوانی در برخی افراد و وجود پاتوژن هاي آلرژي زاي خاص گونه حیوانی اشاره کرد. لذا درج اطلاعات بـر روي برچسـب محصـولات غـذایی می بایست دقیق باشد تا مصرف کننده بتواند انتخاب آگاهانه در مورد رژیم غذایی خود و محصول مصرفی داشته باشد. ما در این مقاله به بررسی و شناسایی تقلب شیر گاو در پنیرهاي گوسفندي (برند لیقوان) از طریق  PCR اختصاصی می‌پردازیم.

چرا پنیر گوسفندی لیقوان؟

پنیر از جملـه محصـولات لبنـی اسـت کـه در تهیـه آن می توان از شیرهاي گونه هاي مختلف حیوانی استفاده نمـود و تقلب شیر در آن به راحتی اتفاق می افتد. در پاسخ به افزایش مطالبه بـراي شـفافیت در تجـارت مـواد غذایی، قوانین اروپا (و بسیاري کشـورها) تولیـد کننـدگان را ملزم به اعلام نوع شیر مصرف شده جهت تولید پنیر یا سـایر فراورده هاي شیري خود کرده اسـت. ریشـه تولیـد پنیـر لیقوان به دهستان لیقوان در دامنه هاي شمالی سهند در ۲۰ کیلومتري باسمنج و  ۳۰ کیلومتري جنـوب شـرقی تبریـز در جوار رودخانه اي به نام لیقوان چاي بر می گـردد و ایـن پنیـر تنها از شیر گوسفند تولید می شود که با توجه به قیمت بالاتر آن نسبت به شیر گاو، استفاده از شیر گاو براي کسـب سـود بیشتر توسط سودجویان می تواند صـورت گیـرد کـه توسـط مصرف کنندگان قابل تمیز نمی باشد.

روش های شناسایی تقلب شیر گاو در پنیرهاي گوسفندي

روش هاي مختلفی براي شناسایی نوع شیر بکـار رفتـه در محصــولات لبنــی وجــود دارد. از آن جملــه، مــی تــوان بــه روش هــاي ایمونولــوژیکی، الکتروفورتیــک و تکنیــک هــاي کرومـاتوگرافی اشـاره کـرد. در ایـن میـان انـواع روش هـاي الکتروفورز  HPLC و ELISA در اروپـا بـه طـور گسترده براي شناسایی شیر گاو اسـتفاده شـده انـد. اگر چـه روش هاي ایمونولوژیک و الکتروفورتیک همیشه نمـی تواننـد شیر گونه هاي نزدیک به یکدیگر مانند گاو و بوفـالو یـا بـز و گوسفند را از یکدیگر تشخیص دهند و اغلب براي شناسـایی مواد حرارت دیده مناسب نیستند. روش هـاي کرومـاتوگرافی نیز تنها قادر به شناسایی اختلاف چند درصدي از اسـیدهاي چرب می باشد.

در سال هـاي اخیـر روش هـاي مولکـولی براي شناسایی گونه هاي مختلف به کار گرفته شده اند و ثابت شده که قابل اعتماد، حسـاس و سـریع هسـتند کـه در ایـن میان واکنش زنجیرهاي پلیمراز  (PCR) بـه طـور گسـترده و بیش از سایر تکنیـک هـاي مولکـولی بـراي تشـخیص گونـه حیوانی بکار رفته در مواد غذایی مورد اسـتفاده قـرار گرفتـه است. البته بررسی تصدیق محصولات لبنـی در مقایسـه با سایر مواد غذایی مثل گوشت و ماهی کمتر به وسیله PCR بررسی شده است.

مطالعات نشان داده کـه مـی تـوان از شیر به دلیل دارا بودن سول هاي سـوماتیکی، لکوسـیت هـا و سلول هاي اپیتلیال غدد شیري به عنوان منبـع   DNA جهـت استفاده در آزمایشات مولکولی از جمله   PCR اسـتفاده نمـود. هدف از این مطالعه بهینه سازي واکـنش  Specific-PCR بــراي تکثیــر ژن هــاي میتوکنــدریایی گونــه هــاي گــاوي و گوسـفندي، جهـت بررسـی تقلبـات احتمـالی در پنیرهـاي گوسفندي صنعتی موجود در بازار می باشد.

نمونه برداري:

۱۸برند مختلف پنیر از سراسر استان تهـران جمع آوري شد و از  ۱تا  ۱۸شماره گذاري شدند.

از شیر گـاو و گوسفند نیز به عنوان کنترل مثبت (شاهد) اسـتفاده شـد.

نمونه ها در یخچال تا زمان استخراج   DNA نگهداري شدند. استخراج  ۰/۹ :DNA گرم از هر نمونـه در میکروتیـوپ هـاي  ۱/۵ ml جداگانه قرار داده شد. بعد ۶۰۰ µlاز بافر اسـتخراج (CTAB) شـامل (1M Tris HCL pH 8.0, 4M NaCL)، (۰.5M EDTA pH 0.8, 2g CTAB) و ۵۰ میکرولیتـر از پروتئیناز (۲۰ng/µl) Kبرند ویوانتیس بـه آن اضـافه شـد و داخل بن ماري ۶۵˚C به مدت ۳ساعت قـرار داده شـد.

لازم به ذکر است تمامی مـواد مـورد اسـتفاده در بـافر اسـتخراج متعلق به برند مرك بودند. پس از خروج میکروتیوپ ها از بن ماري نمونه ها در  ۱۲۰۰۰ rpm و دمـاي ۴ ˚C بـه مـدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ شدند.

در این مرحله، فاز رویی هر یک از نمونه ها جداسازي شد و بـه میکروتیـوپ دیگـري منتقـل گردیـد. بـه هـر یـک از میکروتیوپ ها و هم حجم فاز رویی کلرفرم سرد افزوده شد و ســپس  ۱۶ثانیــه ورتکــس گردیــد، ســپس در ســانتریفوژ  12000r pmدر دماي  ۴ ˚C به مدت  ۱۰دقیقـه قرارگرفـت.

پس ازسانتریفوژ، لایه بالایی برداشته شد و برابـر حجـم فـاز رویی، مجدداً کلروفرم سرد افزوده شد و مانند مرحله اول ۱۶ ثانیه ورتکس گردید و بعد از  ۱۰دقیقـه سـانتریفوژ (مطـابق مرحله اول)، فاز رویی برداشته شد و به میکروتیـوپ دیگـري منتقل شد. سپس هم حجم فاز برداشته شـده ایزوپروپـانول سرد به این فـاز افـزوده شـد و  ۱۵تـا  ۲۰دقیقـه بـه آرامـی اینورت  (invert) گردید سپس در سـانتریفوژ  12000rpm در دماي  ۴ ˚C به مدت  ۱۰دقیقه قرار گرفت. بعد، کل محتـواي میکروتیوپ تخلیه گردید.

در هر میکروتیوپ  ۲۰۰ µlاتانل  %۷۰سرد اضافه شد. بعد از  ۱۰دقیقــه اینــورت کــردن بســیار آرام، در ســانتریفوژ ۱۲۰۰۰ rpm در دماي  ۴ ˚Cبـه مـدت  ۱۰دقیقـه قـرار داده شد تا  DNA غیر محلول رسوب نماید. بعد کـل محتویـات را خالی کرده و میکروتیوپ در یک انکوبـاتور  ۴۵ ˚Cبـه مـدت  ۲۰دقیقه قرار داده شد تا اتانول بـاقی مانـده خشـک شـود.

سپس جهت حـل نمـودن رسـوب  ۵۰ µl ،DNA آب مقطـر تزریقی به آن اضافه شد و به مدت یک شب در یخچال قـرار گرفت تا  DNA فرصت انحلال بیشتري در آب پیدا کند. پس از ارزیـابی   DNA اسـتخراج شـده، بـه فریـزر  – ۲۰ تـا انجـام واکنش هاي بعدي   PCR انتقال داده شـدند. اسـتخراج  DNA بـر اسـاس روش  Sambrook و همکـاران (۱۹۸۹) بـا اعمـال تغییرات انجام گردید.

پرایمرهاي الیگونوکلئوتید:

پرایمرهاي اختصاصی براي ژن سیتوکروم b گونه هاي گاو و گوسفند جهت تشخیص دو گونه فوق در نمونه ها، انتخاب گردید. توالی پرایمرهاي مورد نظر جهت سنتز به شرکت تکاپو زیست سفارش داده شدند.

واکـنش زنجیـرهاي پلـیمـراز:

در ابتـدا جهـت تعیـین اختصاصی بودن پرایمرهاي ویژه گونه هـاي گـاو و گوسـفند، نمونه شاهد (شیر گاو و گوسفند) مورد استفاده قـرار گرفـت. براي این منظور،  PCR اختصاصی با پرایمر خاص هر گونـه و همراه با  DNA همان گونه انجام شد. براي اطمینـان از عـدم واکنش متقاطع پرایمرها با گونه هـاي مـورد مطالعـه ( cross  reaction)، پرایمر اختصاصی گاو با  DNA گوسفند و پرایمـر اختصاصی گوسفند با   DNA گـاو طـی واکـنش  PCR مـورد ارزیـابی قـرار گرفـت.

سـپس واکـنش نهـایی  PCR بـر روي نمونه هاي پنیر انجام شد. واکنش   PCR در حجـم نهـایی  µl µl Amplicon Master Mix   میکرولیتـر از۱۲/۵ ، شامل۲۵  ۰/۵ از پرایمرهــــا ( ۰/۴میکرومــــولار) و  ۵۰ ngاز DNA نمونه هاي استخراج شده انجام شد.

واکنش  PCRدر دستگاه ترموسایکلر  (Bio Rad, USA) طبـق چرخـه دمـایی مرحلـۀ دناتوراسیون ابتدایی در  ۹۵ °C براي  ۱دقیقه،  ۳۰چرخه بـه شرح زیر برنامه ریزي شد:

۹۴°C براي  ۱دقیقه،

۶۵°C براي  ۱دقیقه،

۷۲°C براي  ۹۰ثانیه

و مرحله گسترش نهـایی در  ۷۲°C براي  ۵ دقیقه انجام گرفت.

محصول  PCR بر روي ژل آگارز  %۲ شامل بافر  ۱ X TBE بارگزاري شد و توسط دستگاه ژل داك عکسبرداري گردید.

 یافته ها

ارزیــابی اســتخراج  :DNA نتــایج آزمــایش کمــی  DNA استخراج شـده بـا اسـتفاده از نـانودراپ (Thermo 8000) در محدوده  ۱/۷ -۲ ارزیابی شد. بررسی کیفی   DNA بر روي ژل آگارز نیز انجام گرفت که نشان دهنده کیفیـت بـالاي  DNA استخراجی بود.

در حقیقت نتایج استخراج   DNA از نمونه هـا حاکی از مناسب بـودن   DNA اسـتخراج شـده بـراي انجـام واکنش  PCR بود.

 PCR اختصاصی

در مرحلۀ ابتدایی ایـن تحقیـق، واکـنش PCR بر روي   DNA استخراج شده نمونه هاي شاهد(شیر گاو و گوسفند) با پرایمرهاي اختصاصی هر گونـه انجـام گردیـد.

پرایمر اختصاصـی گـاو و گوسـفند بـه ترتیـب سـبب تکثیـر قطعات  ۲۷۴ bp و  336bp شـدند. جهـت تشـخیص واکـنش متقاطع DNA هاي گونه گاو و گوسفند با پرایمـر اختصاصـی گونه غیر هدف، واکـنش  PCR بـا  DNA غیرهـدف گونـه هـا انجام گردید که اختصاصی بودن پرایمر هر کـدام از گونـه هـا تأیید شد. این آزمایش چند بار تکـرار شـد و نتـایج در تمـام آزمایش ها یکسان بود که این موضوع نشان دهنده تکرار پذیر بودن این آزمایش بود.

نتایج حاصل از  PCR با پرایمرهاي اختصاصی گاو و گوسفند نشان داد که در هشت مورد از پنیرهاي مورد مطالعه فقط شیر گاو، در سه مورد هم شیر گاو و هم شیر گوسفند و در هفت مورد نیز فقط شیر گوسفند بکار رفته است و این نشان دهنده ی تقلب شیر گاو در پنیرهاي گوسفندي است.

بنابراین در  ۱۱پنیر از  ۱۸پنیرهاي مورد مطالعه، تقلب شیر گاو در پنیرهاي گوسفندي تایید گردید. این در حالی است که بر روي برچسب محصولات عبارت  %۱۰۰پنیر گوسفندي قید شده بود.

بحث

شهرت داخلی و خارجی پنیر گوسفندي موسوم به لیقوان موجـب شـده کـه عـده اي از تولیدکننـدگان نقـاط مختلـف آذربایجـان و اسـتان هـاي شـمال غـرب و امـروزه تقریبـاً در بسیاري نقاط دیگر کشور، برند موسوم به “لیقـوان” را بـراي پنیر تولیدي خود استفاده کنند.  حتی روزانه چند محمولـه پنیر از این استان ها به لیقوان حمل می شود تا به نام لیقـوان صادر شود که این مسئله سبب افزایش اهمیت بررسـی تقلب شیر گاو در پنیرهاي گوسفندي و مـواد اولیه براي تولید این محصول و آگـاهی مصـرف کننـدگان از صحت مندرجات به کار رفته بـر روي محصـولات مـی شـود.

مقررات برچسب زنـی مـواد غـذایی نیازمنـد ایـن اسـت کـه گونه هاي حیوانی در محصولات لبنی از جمله پنیر به درستی و با دقت به مصرف کننده اعلام شود که ایـن امـر منجـر بـه پیدایش روش هاي قابـل اعتمـاد و اختصاصـی بـراي تعیـین گونه هاي حیوانی در محصولات مختلف غـذایی و شناسایی تقلب شیر گاو در پنیرهاي گوسفندي شـده اسـت.

شیر نشخوار کنندگان حاصل از غده هاي شـیري سـالم داراي مقـدار زیـادي از سـلول هـا مـی باشـد از جملـه سـلول هـاي سوماتیک، لکوسیت ها و همچنین سـلول هـاي اپیتلیـال کـه داراي   DNA هستند. سلول هاي سـوماتیک شـیري در طـول تهیه و تولید پنیـر بـاقی مـی ماننـد و منبـع مناسـبی بـراي استخراج   DNA و ردیابی گونه حیوانی از شـیر و محصـولات آن به شمار مـیرونـد. از طرفـی، شـیر سرشـار از کلسیم و چربی می باشد که هر دو جز ممانعـت کننـده هـاي واکنش زنجیرهاي پلیمراز (PCR) به حسـاب مـی آینـد. بنابراین اگر در طی مراحل استخراج حذف نشوند مشـکلاتی را در واکنش هاي فرودستی ایجاد می نمایند.

با توجه به نـوع روش به کار رفته در استخراج در این مطالعه، کلیه چربی ها، پروتئازها و کلسیم از ژنوم سلولی جدا گردید و   DNA خاص جهت فرآیند   PCR در اختیار قـرار گرفـت. در ایـن تحقیـق، شناسایی حضور شیر گاو و گوسفند در پنیرهـاي گوسـفندي (لیقوان) که به طور اصـولی تنهـا بایـد داراي شـیر گوسـفند باشد با کمک روش   PCR بـر اسـاس تکثیـر قطعـه اي از ژن سیتوکرو م  b میتوکندریایی به وسیله پرایمرهـاي اختصاصـی آنها براي گونه هاي گاو و گوسـفند بـه طـور مجـزا صـورت گرفت.

در سال هاي اخیر با به کارگیري روش  ،PCR مطالعاتی در زمینه بررسی تقلبات محصولات لبنی بر پایـه تکثیـر نـواحی مختلف ژنوم میتوکندریایی صورت گرفتـه اسـت. بـه عنـوان مثال، بررسی وجـود شـیر گـاو در شـیر بوفالوهـا و در پنیـر موزارلا که با شیر بوفالو تولید می شود توسط  Lopez-Calleja و همکاران به کمک   PCR و پرایمرهاي طراحی شده جهـت تکثیـر قطعـه اي از ژن  12s rRNA انجـام شـد.

In´es L´opez و همکـاران از تکثیـر ژن  12s rRNA جهــت شناســایی شــیر بــز در پنیرهــاي گوســفندي اســتفاده کردند .  Samahو همکاران با پرایمرهاي اختصاصی ژن 12s  rRNAمیتوکندریایی به شناسایی تقلـب شـیر گـاو در شـیر بوفالو پرداختند. جهت شناسایی تقلب شیر و پنیر گـاو و بوفالو و شیر گاو در شیر بـز بـه ترتیـب  Sachinandan De  و  Monika Kotowicz از پرایمرهـاي اختصاصـی  D Loop میتوکنـــدریایی اســـتفاده کردنـــد.

پرایمرهـــاي اختصاصـی ژن هـاي  16s rRNAو  12s rRNA در واکـنش  Multiplex-PCRجهت شناسایی شیر گاو، بز و گوسـفند در محصولات لبنـی مـورد اسـتفاده قرارگرفتـه اسـت. در مطالعه اي مشابه   EVA MAŠKOVÁو همکاران به بررسی حضور شیر گاو در پنیرهاي تولیدي از شیر بز و گوسـفند در محصولات چند شرکت اروپایی بر پایه تکثیر ژن سیتوکروم  b میتوکندریایی پرداختند.

در تحقیق حاضر سعی شـده اسـت روش دقیـق، سـریع، مطمئن و تکرار پذیر براي شناسایی شیر گـاو و گوسـفند بـه کار رفته در محصولات لبنی معرفی شود. بدین منظور، براي شناسایی گونه هاي گـاو و گوسـفند از   DNA میتوکنـدریایی استفاده شد. زیرا   DNAمیتوکندریایی به دلیل ویژگـی هـاي منحصر به فرد وراثت مادري، تعـداد کپـی هـاي بـالا در هـر سلول، سرعت بالاي جهش و این که این ژن به ندرت دچـار نوترکیبی می شود، منحصر به فرد می باشـد، پلـی مورفیسـم DNA میتوکندریایی به طور گسترده براي شناسایی گونه هـا استفاده می شود. نشان داده شده که مقاومت حرارتی و تعداد کپی هاي زیاد  DNA میتوکندریایی بـه حفـظ و بقـاي قطعات  DNA میتوکندریایی در مقایسه بـا  DNA هسـته اي کمک میکند تا به اندازه کافی به وسیلۀ   PCR تکثیـر شـود. زیرا به دلیل تعـداد کپـی هـاي بـالاي   DNA میتوکنـدریایی،کوچک، دورشته اي و حلقـوي بودنشـان در سـلول، شـانس بقاي آنها تحت شرایط مختلف فـرآوري و پاستوریزاسـیون، بیشــتر اســت. ایــن دلایــل، ژنــوم میتوکنــدریایی را جهــت شناسایی گونه هاي حیوانی در محصولات فرآوري شـده ایـده آل ساخته است.

از طرفی چون احتمال شکسته شـدن مولکـــول  DNA در طـــی فرآینـــد پاســـتوریزه شـــدن و استریلاسیون وجود دارد، در این تحقیق سعی شـده اسـت از پرایمرهایی استفاده شود که طول قطعاتی که تولید می کنند کوتاه باشد  (۲۷۴ ,۳۳۶ bp) تا شانس تکثیر و ردیابی حضـور ژنوم اختصاصی مورد نظر در طی واکنش  PCR افزایش یابـد.

با بررسی هاي نرم افزاري، ناحیه مشترك براي  ۲ گونه هـدف بـراي پرایمرهـا پیـدا نشـد و ایـن مسـئله در آزمایشـگاه بـا آزمایشـات  PCR اولیـه تأییـد گردیـد. عملکـرد اختصاصـی پرایمرها با انجام  PCR هاي مقدماتی با  DNA استخراج شده از شیر گاو و گوسفند تأیید شدند. تکنیک  PCR با بکارگیري یک پرایمر رفت مشترك (forward) و دو پرایمـر اختصاصـی برگشت  (reverse) گونه گاو و گوسفند بهینه سازي شد.

هـر جفت پرایمر تنها سبب تکثیر قطعه مورد نظر در گونه هدف شدند و هـیچ واکـنش متقـاطعی حاصـل نشـد. پرایمرهـاي اختصاصی گاو، تنها قطعه  ۲۷۴ bp از  DNA میتوکندري گـاو را تکثیر نمود و هیچ قطعـه اي از  DNA گوسـفندي را تکثیـر نکرد و همچنین پرایمرهـاي اختصاصـی گوسـفند قطعـه bp  ۳۳۶ از سیتوکروم  b میتوکندري گوسـفند را تکثیـر نمـود و نتیجه واکـنش بـا  DNA گـاو منفـی بـود.

متعاقبـا روش بـا استفاده از  DNA استخراج شده از پنیرهاي تجاري تهیه شده انجام شـد. نتـایج واکـنش  PCR حـاکی از ایـن بـود کـه در پنیرهاي تجاري شماره ۱۲ ،۱۱ ،۸ ،۴ ،۳ ،۲ ،۱و  ۱۴منحصراً از شیر گاو، پنیرهاي  ۶ ،۵و  ۷هم از شیر گاو و هم گوسفند و در پنیرهــاي  ۱۷ ،۱۶ ،۱۵ ،۱۳ ،۱۰ ،۹و  ۱۸فقــط از شــیر گوسفند استفاده شده است.

چرا که تکثیر ژن سیتوکروم  bبا قطعه  ۲۷۴ bp در پنیرهاي شـماره ۱۲ ،۱۱ ،۸ ،۴ ،۳ ،۲ ،۱و  ،۱۴ تکثیر قطعات  ۲۷۴ bp و  ۳۳۶ bp در پنیرهاي  ۶ ،۵و ۷ و تکثیر قطعه  ۳۳۶ bp ژن سیتوکروم  b در پنیرهاي ،۱۰ ،۹  ۱۷ ،۱۶ ،۱۵ ،۱۳و  ۱۸تایید کننده نوع شـیر بکـار رفتـه در پنیرهاي مورد مطالعه می باشد و وجود تقلـب در  ۱۱پنیـر از  ۱۸پنیر مورد بررسی از جمله پنیرهـاي ،۷ ،۶ ،۴،۵ ،۳ ،۲ ،۱ ۱۲ ،۱۱ ،۸و  ۱۴را به اثبات می رساند که بر خـلاف اظهـارات قید شده بر روي محصولات می باشد.

براي جلوگیري از به خطر افتـادن سـلامت عمـومی و بـراي حصول اطمینان مصرف کنندگان از صـحیح بـودن اطلاعـات درج شــده روي محصــولات، گســترش یــک تکنیــک قابــل اطمینان براي تشخیص تقلبات موجود در شیر و محصـولات لبنی الزامی می باشد.

در این بررسی سعی شده روشی آسان، حساس و با دقت بالا براي شناسایی گونه هاي گاو و گوسفند بکار رفته در پنیر و سایر محصولات لبنی به سازمان سازمان غذا و دارو (اداره نظارت بر مواد غذایی) ارائه شـود تـا بتـوان گــامی مــؤثر در جلــوگیري از انجــام تقلب در پنیرهاي گوسفندي و اســتفاده از شیرهاي ارزانتر مثل شـیر گـاو بـه جـاي شـیر گوسـفند یـا مخلوط نمودن این دو شیر با یکدیگر براي حفظ سود بیشتر براي تولید کنندگان برداشت. لازم به ذکر است روش بهینـه سازي شده در این تحقیق قابل تعمیم در سایر فرآورده هـاي لبنی می باشد. این پژوهش توسط گروه زیست شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد پرند، تهران انجام گرفته است. با تشکر از زحمات این عزیزان.

مطالب مرتبط: