کامل‌ترین روش‌های شناسایی باکتری بروسلا در شیر خام و پنیر

در این مقاله به بررسی و شناسایی  باکتری بروسلا ( Brucella.spp) در نمونه های شیر خام و پنیر به وسیله تکنیک Hemi Nested PCR  می پردازیم.

باکتری بروسلا ( Brucella.spp) چیست؟

بروسلاها باکتری های گرم منفی کوچک، داخل سلولی اختیاری، شدیداً هوازی و سخت رشدی هستند که در گاو، گوسفند، بز و انسان ایجاد بروسلوز، بیماری مشترک بین انسان و دام می کنند.

طبقه بندی باکتری بروسلا ( Brucella.spp)

بروسلاها بر اساس تفاوت در میزبان اصلی و بیماری زایی به شش گونه طبقه بندی می شوند. بروسلا آبورتوس عامل تب مالت گاوی می باشد که در انسان ایجاد تب مواج (بروسلوز) می نماید، البته این بیماری توسط گونه های بروسلا ملی تنسیس، بروسلا سویس و بروسلا کانیس هم ایجاد می شود.

شرایط زندگی و بیماریزایی باکتری بروسلا ( Brucella.spp)

گونه هاي بروسلا مي توانند در گوشت یخ زده، به مدت سه هفته، در شیر خام به مدت  ۱۰روز، در پنیر تازه تا سه ماه و در بستني و خامه نیز تا مدتي زنده بمانند. این میکروارگانیسم ها در حرارت  ۶۰ درجه سانتي گراد یا در اثر مجاورت با فنول  %۱در عرض  ۱۵ دقیقه از بین مي روند ولي در طبیعت مي توانند تا مدت ها زنده باقی بمانند.

بیماری بروسلوز

بروسلوز مشکل بهداشتی در سطح جهان است. این بیماری در تمام نقاط دنیا وجود داشته و فقط  ۱۷ کشور جهان به عنوان کشور عاری از بروسلوز شناخته شده اند. از طرف دیگر علی رغم کوشش های بسیار جهت ریشه کنی بیماری در بسیاری از کشورها تعداد موارد بروسلوز در حیوانات و انسان رو به افزایش است. یکی از راه های اصلی انتقال بیماری بروسلوز به انسان از طریق مصرف شیر و فرآورده های آن است. در نتیجه این بیماری از نظر بهداشت عمومی بسیار حائز اهمیت است.

روش های تشخیص بروسلا ( Brucella.spp)

روش های تشخیص بروسلا شامل کشت، روش های سرولوژیک بر مبنای واکنش آنتی ژن آنتی بادی می باشد که شامل تست های مختلفی مانند SAT ،RBT  کومبس ایمونواسی وابسته به آنزیم و تست پوستی می باشد. علی رغم توسعه فراوان و دسترسی آسان تست های سرولوژیک مشکل مهم این تست ها ایجاد نتایج مثبت کاذب به دلیل واکنش متقاطع با آنتی ژن های سایر میکروارگانیسم ها مانند یرسینیا انتروکولیتا ،سالمونلا اورینتالیس ، ویبرو کلرا ،فرانسیلا تورانسیس ، اشریشیا کلی می باشد.  بنابر این ایمنی در مقابل این عوامل باعث ایجاد نتایج مثبت کاذب می شود بعلاوه این روش ها قابلیت تشخیص بیماری در هفته های اول آلودگی را نداشته، بنابراین استفاده از روش های مولکولی به عنوان تست های تاییدی ضرورت یافته است.

روش های مولکولی تشخیص بروسلا ( Brucella.spp)

روش های مولکولی بسیاری، از جمله PCR و مشتقات آن، تکنیک های بر مبنای هیبریداسیون، مالتیپلکس  NASBA ،SNP ، PCR8 بر مبنای تشخیص اسید نوکلئیک توسعه یافته اند. یکی از مشتقات   PCR تکنیک PCR  Nestedمی باشد که راه حلي براي افزایش حساسیت و دقت  PCR است و جداسازي محصول اختصاصي مورد نظر را از بین انبوه محصولات غیر اختصاصي میسر مي سازد.

در این روش از دو جفت پرایمر استفاده مي شود طوري که جفت دوم در بین جفت اول جاي مي گیرند ابتدا پرایمرهای اول (پرایمر بیروني) اضافه مي شوند و باعث تکثیر قطعاتي از  DNAمي شوند که احتمالا تعدادي از آن ها محصولات غیر اختصاصي اند. محصول PCR واکنش اول به عنوان   DNAالگو براي   PCRدوم در حضور پرایمرهاي داخلي (پرایمردوم) که مکمل قسمت داخلي تر قطعه   DNAمورد نظر است مورد استفاده قرار مي گیرد. احتمال بسیار ضعیفي وجود دارد که محصولات غیر اختصاصي براي جفت پرایمر داخلي اختصاصي دیگر نیز داراي محل شناسایي باشند نتیجتاً این امر باعث افزایش نسبت محصول واقعي به محصول غیر اختصاصي خواهد شد.

هدف از این مطالعه

هدف از این مطالعه استفاده از تکنیک  Hemi Nested PCR به عنوان یک روش مولکولی دقیق برای تشخیص گونه های باکتری بروسلا در نمونه های شیر خام و پنیر است. حساسیت و ویژگی و اختصاصی بودن این روش با استفاده از  ۳پرایمر ویژه، مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش ها

تهیه نمونه ها:

در این بررسی  ۱۵نمونه شیر خام و ۱۵ نمونه ی پنیر پاستوریزه و همچنین  ۱۵نمونه ی پنیر سنتی از سطح استان تهران جمع آوری گردید.

 استخراج DNA از سوش Brucella. Spp:

برای بهینه نمودن تست  PCRجهت تشخیص بروسلا، DNA از سوش استاندارد این باکتری به روش جوشاندن و(DNG (cat:DN811530  استخراج گردید.

مواد لازم جهت تست PCR:

هر واکنش شامل  ۵میکرولیتر الگو ( DNAاستخراجی از نمونه،)  ۲/۵میکرولیتر از 10X PCR  ۱ ، Bufferمیکرولیتر از هر یک از دو پرایمر (Bru Up, Bru 0/5 ،50mM MgCl2  میکرولیتر از۰/۷۵ ، 10mM )Low میکرولیتر از  ۰/۴، 10mM dNTP میکرولیتر Taq DNA  Polymerase 5 u/µlدر حجم نهایی  ۲۵ میکرولیتر می باشد.

واکنش مرحله دوم با همان مقادیر بهینه گردید. در واکنش مرحله دوم به جای  DNA الگو از محصول راند اول استفاده شد. پرایمرهای مورد استفاده در مرحله دوم شامل پرایمرهای می باشد. توالی پرایمرها به قرار ذیل می باشد.

Bru Low 5` GGG CAA GGG TCG GTG TTT3` Bru In 5` GGG ACG GGC AGG CGA GAG3` Bru up 5` GGG CAA GGT GGA AGA TTT 3`

چرخه دمایی واکنش  PCR:

در مرحله اول واکنش به صورت دماي دناتوراسیون اولیه در  ۹۵درجه سانتي گراد به مدت ۳ دقیقه، دناتوراسیون در دمای  ۹۴درجه سانتی گراد به مدت  ۳۰ثانیه، چسبیدن در دمای  ۵۶درجه سانتي گراد به مدت ۳۰ ثانیه و پلیمریزاسیون در دمایي  ۷۲درجه سانتي گراد به مدت  ۳۰ثانیه به تعداد  ۴۰سیکل، بهینه گردید. بعلاوه مرحله دوم واکنش به صورت دناتوراسیون در دماي  ۹۴درجه سانتي گراد به مدت  ۳۰ثانیه و چسبیدن در  ۷۰درجه سانتي گراد به مدت ۳۰ ثانیه و پلیمریزاسیون در دمایي  ۷۲درجه سانتي گراد به مدت  ۳۰ثانیه به تعداد  ۴۰سیکل، بهینه شد.

ارزیابي محصول PCR:

برای بررسی محصول تکثیر یافته از ژل آگارز  %۱/۵استفاده گردید، رنگ آمیزی ژل با استفاده از سایبر گرین  SYBR safe ( 0/0001سیناژن) انجام شد.

بررسي حساسیت تست  :PCRبراي برآورد میزان بروسلا در یک حجم معین، از رقتهاي متوالي کشت بروسلا ( از  ۱میلیون تا  ۱۰پارتیکل)  DNAاستخراج و تست  PCRبا  DNAي با تعداد مشخص انجام شد.

بررسی اختصاصیت تست

:PCRجهت تأیید تست اختصاصیت،  PCRبهینه شده با  DNA استخراج شده و چند میکروارگانیسم از جمله ویروس هرپس سیمپلکس ( HSV) سایتومگالوویروس (CMV) وارسیلا زوستر (VZV) هپاتیت بیB (HBV) هپاتیت سی ( HCV) ساکارومیسس سرویزیه ( DNA(Saccharpmices انساني،  DNA موش به همراه کنترل منفي مورد مطالعه قرار گرفت.

انجام تست  PCR برای شناسایی بروسلا در نمونه ها:

در این مطالعه  ۴۵نمونه  DNAمحصول لبنی (شامل  ۱۵نمونه شیر خام،  ۱۵نمونه پنیر پاستوریزه،  ۱۵نمونه پنیر سنتی ) جمع آوری گردید.  DNAی نمونه های هر جمعیت به عنوان الگو در تست  PCR مورد ارزیابی قرار داده شد.

یافته ها

نتیجه بهینه سازی راند اول تست  :PCRمحصول  PCRبر روی ژل آگارز  %۱/۵بارگذاری شد. اندازه قطعه بدست آمده با استفاده از پرایمرهای بیرونی (مرحله اول)  ۴۴۳ bp می باشد.

نتیجه بهینه سازی محصول مرحله دوم تست PCR:

DNA الگوی مورد استفاده در این واکنش، محصول واکنش مرحله اول می باشد. محصول تکثیر شده را در کنار نمونه کنترل منفی و سایز مارکر بر روی ژل الکتروفورز مورد ارزیابی قرار داده شد. باند حاصل از محصول  ،PCR در مرحله دوم واکنش  ۲۲۵جفت باز طول داشت نتایج مربوط به آزمون های  PCR انجام شده بر روی نمونه های شیرخام: از  ۱۵نمونه شیر غیر پاستوریزه (خام) در ۵ نمونه ( %۳۳/۳۳) در دور اول تست  PCR مثبت ارزیابی گردید. از این نمونه ها،  ۱۰مورد ( %۶۶/۶۶) در راند دوم مثبت شدند.

نتایج مربوط به آزمون های  PCR انجام شده بر روی نمونه های پنیر پاستوریزه: از  ۱۵نمونه پنیر پاستوریزه ۱ نمونه ( %۶/۶) در دور اول تست  PCR مثبت ارزیابی گردید. از این تعداد  ۶نمونه ( %۴۰) در دور دوم مثبت ارزیابی گردید.

نتایج مربوط به آزمون های  PCR انجام شده بر روی نمونه های پنیر سنتی:

از  ۱۵نمونه پنیر سنتی در  ۴نمونه ( %۲۶/۶) در دور اول تست  PCR مثبت ارزیابی گردید. در تست  PCR دور دوم  ۸نمونه ( %۵۳/۳۳) مثبت شدند.نتایج چند نمونه  PCR مرحله اول نمونه های شیر خام، پنیر سنتی و پاستوریزه نمایش داده شده است.

نتیجه تعیین اختصاصیت آزمون  PCRبهینه شده:

برای تعیین اختصاصیت تست  PCR بهینه شده تا  ۱۰۰پارتیکل محاسبه گردید. تست  PCRبهینه شده از اختصاصیت بسیار بالایی برخوردار بود به طوری که به جز  DNA باکتری بروسلا با هیچ کدام از  DNAهای مورد مطالعه واکنشی صورت نگرفت.

بحث

شیر و فراورده های لبنی به لحاظ دارا بودن ارزش غذایی بالا، در تغذیه انسان دارای نقش به سزایی هستند. از سوی دیگر به علت دارا بودن اکثر عناصر و ترکیبات غذایی ، محیط بسیار خوبی جهت رشد و فعالیت بسیاری از میکروارگانیسم های بیماری زا می باشند.

بنابراین عدم رعایت اصول بهداشتی در تهیه و نگهداری فراورده های لبنی، عوارض و خطرات بهداشتی عدیده ای را در مصرف کنندگان این قبیل مواد غذایی به همراه خواهد داشت. بروسلوز یکی از خطرناک ترین بیماری های عفونی است که از طریق مصرف شیر و فراورده های لبنی آلوده به انسان انتقال می یابد. پنیرهای تازه به دلیل آن که از شیر غیر پاستوریزه تهیه و نیز فرایند تخمیری در آن به طور کامل صورت نمی گیرد. در صورت آلوده بودن، به راحتی عامل تب مالت را در خود حفظ نموده و به مصرف کنندگان آن منتقل می نماید.

از آنجایی که عامل بیماری بروسلوز (تب مالت) از طریق ترشحات شیر دام های آلوده دفع می گردد، مصرف فراورده های شیری غیر پاستوریزه در مناطق آلوده به بروسلوز یکی از عمده ترین راه های انتقال بیماری تب مالت به انسان محسوب می شود. عامل بیماری بروسلا یک کوکوباسیل کوچک، غیر متحرک، گرم منفی و بدون اسپور می باشد که در محیط هوازی رشد می نماید. در مقابل خشک شدن نسبتاً مقاوم بوده و مدت طولانی در دمای پایین زنده می ماند، مواد ضد عفونی کننده مانند فرمالدئید، هیپوکلریت و فنل میکروارگانیسم را از بین می برند. این میکروب با پاستوریزاسیون نیز کشته می شود.

مصرف شیر خام و فراورده های لبنی آلوده غیر پاستوریزه و یا نجوشیده مانند، خامه، پنیر تازه، بستنی، آغوز، معمول ترین و مهم ترین راه انتقال بیماری می باشد. همچنین مصرف فراورده های حیوانی آلوده سبب بروز بیماری در انسان می شود. مواد غذایی سنتی، نقش مهمی در انتقال بیماری دارند. با تحقیقات انجام شده توسط محققین، از  %۷پنیرهای تازه محلی عرضه شده در مغازه های مختلف مواد غذایی در ایران، باکتری نوع بزی جداشده است. همچنین امکان جدا سازی این باکتری تا  ۱۱هفته پس از تولید پنیر، از این فرآورده وجود داشته است.

گسترش جهانی بروسلوز

این بیماری را هنوز از معضلات جدی سلامتی در انسان و حیوانات اهلی بشمار می آورد. اگرچه آمار انتشار یافته از شیوع این بیماری در کشورهای مختلف متفاوت است ، شیوع دقیق بروسلوز انسانی مشخص نیست ،اما آمار انتشار یافته بین  ۰/۰۱تا  ۲۰۰ مورد و در ایران  ۱۳۲/۴در  ۱۰۰۰۰۰جمعیت است. لذا کنترل بیماری از اهمیت خاصی برخوردار است . روش های سرولوژیک تشخیص بروسلوز انسانی شامل آزمایش های رز بنگال، سروآگلوتیناسیون، رایت، مرکاپتواتانول، ثبوت عناصر مکمل و آنتی گلوبولین کومبس صورت می گیرد.

اکثر بیماران مبتلا به بروسلوز حاد در تمامی آزمایش ها واکنش مثبت نشان می دهند. معمولاً آزمایش های رزبنگال و رایت به جهت آنکه هر دو ایمونوگلوبولین  Gو M در آن ها دخالت دارند زودتر از دیگر آزمایش ها واکنش نشان می دهند. در آزمایش های  مرکاپتواتانول و ثبوت عناصر مکمل  IgG مداخله نموده که از نظر تفکیک وضعیت ایمنی یا عفونت مفید می باشد. در مواردی که آنتی بادی ها وجود داشته باشند آگلوتیناسیون واضح ایجاد نمی نمایند آزمایش کومبس از ارزش خاصی برخوردار است. آنتی ژن های بروسلا، آنتی ژن های  Aو  M هستند که به لیپو پلی ساکارید دیواره سلول باکتری مربوط می باشد. ضمناً بروسلا آنتی ژن مشترک با ویبره کلرا داشته و واکسیناسیون بر علیه و با تیتر آنتی بادی بروسلا را به صورت کاذب با بعضی از آنتی ژن ها ساخته شده بالا می برد.

مهم ترین شکل استفاده از روش های سرولوژیک نتایج مثبت کاذب ناشی از واکنش متقاطع سایر آنتی بادی های باکتری ها با آنتی ژن بروسلا می باشد. بنابر این به منظور تشخیص دقیق بروسلوز بکارگیری روش های مکمل روش های سرولوژیک باید بکار گرفته شود.

تحقیقات اکبر مهر

اکبر مهر در سال  ،۱۳۸۰میزان آلودگی پنیرهای محلی تازه شهرستان سراب را به بروسلا مورد بررسی قرار داد. مطالعات وی نشان داد که  ۱۰۰۰نمونه پنیر محلی مورد مطالعه  ۳۲نمونه به باکتری بروسلا آلوده بودند که از این تعداد  ۷نمونه به بروسلا ملی تنسیس و ۱۵ نمونه به بروسلا آبورتوس آلوده بودند. روش مورد استفاده در این مطالعه کشت در محیط آگار اکسپاندا بود.

تحقیقات حسین دوست

حسین دوست و همکاران در  ۱۳۸۴دو روش کشت و  PCRرا برای تشخیص بروسلا آبورتوس مورد بررسی قرار دادند . آن ها ژن  ISV11را هدف قرار دادند. نتایج مطالعات آن ها نشان داد که از  ۴۲نمونه سرولوژیک مثبت، تنها  ۶نمونه کشت مثبت بودند. به علاوه نتایج مطالعات آن ها نشان داد که حساسیت کشت  %۴۰و حساسیت  %۶۰ PCRدیده شد. پیری دوگاهه و همکاران در سال  ۱۳۸۹از تکنیک  PCRبرای تشخیص بروسلوز انسانی در نمونه های سرم و خون استفاده نمودند.

ژن هدف مورد مطالعه آن ها پروتئین  ۳۱ KDa آنتی ژن بروسلا بود و نتایج مطالعه آن ها نشان داد که از  ۱۰۲فرد مشکوک به بروسلوز،  ۵۶نمونه خون و  ۶۸نمونه سرم  PCRمثبت بودند. آن ها بیان کردند که حساسیت تست  PCRتهیه شده در این مطالعه حساسیت بالاتری بر روی سرم نسبت به خون کامل دارد.

در این مطالعه از تکنیک  Nested PCR استفاده شد که نسبت به  PCRاز حساسیت و اختصاصیت بسیار بالاتری برخوردار بود چرا که از  ۳پرایمر استفاده کرده و احتمال ایجاد نتایج غیر اختصاصی به مراتب کاهش می یابد. بعلاوه با استفاده از دو مرحله  PCR پی در پی حساسیت تست به شدت افزایش یافتبه طوری که تعداد نتایج مثبت در مرحله دوم بیشتر از مرحله اول دیده شد. نمونه هایی که در مرحله اول به دلیل مقدار کم DNA و واکنش ضعیف منفی گزارش شده بودند در مرحله دوم واکنش شدت یافته بطوری که در مرحله دوم نتیجه واکنش مثبت شد.

تاکنون هیچ مطالعه ایی در ایران با استفاده از پرایمرهای مورد بررسی در این مطالعه صورت نگرفته و از این جهت این بررسی دارای تازگی و نو آوری می باشد. با توجه به نتایج می توان بیان کرد تکنیک  Nested PCRیک روش قابل اطمینان با حساسیت و دقت بالاست به طوری که قادر به شناسایی عامل بیماری زا حتی در نمونه های پنیر پاستوریزه است. همچنین نتایج نشان می دهد که که درصد زیادی از نمونه های شیر خام در گاوداری ها به بروسلا آلوده هستند که این امر یک هشدار برای استفاده از روش های موثر جهت از بین بردن عوامل بیماری زا به حساب می آید. بعلاوه نتایج تست بر روی پنیرهای سنتی نشان دهنده عدم سلامت قسمت عمده ای از این پنیرها در سطح شهر بوده که باید فرآیند تولید این پنیرها به طور جدی تغییر یابد. متاسفانه در تعداد زیادی از پنیرهای پاستوریزه نیز نتیجه واکنش مثبت شد که یک فاکتور نگران کننده از جهت بهداشت عمومی به حساب می آید. به نظر می رسد فرایند پاستوریزاسیون این پنیرها از کیفیت لازم برخوردار نبوده و باید در روش های پاستوریزاسیون پنیرها تجدید نظر شود اگر چه باید حضور فرم های زنده اما غیر قابل کشت نیز مورد بررسی قرار گیرد.

نتیجه گیری

با توجه به نتایج می توان بیان نمود که تست  PCR مورد بررسی در این مطالعه از حساسیت و دقت بسیار بالایی برخوردار است همچنین به نظر می رسد روش های مولکولی باید به عنوان روش هایی مکمل جهت تشخیص بروسلا در کنار روش های رایج مورد استفاده قرار گیرند.

مطالب مرتبط: