تولید شير پروبيوتيك معجزه‌ی نوآوری و سلامتی

امروزه مصرف كنندگان مواد غذايي به مواردي مانند طعم مطبوع، پايين بودن كالري و چربي و اثر مفيد غذا بر سلامتي توجه خاصي دارند. از اين رو صنايع غذايي در تلاش است محصولاتي توليد نمايد كه طعم و خواص بهتري داشته باشند كه در اين بين فراورده هاي شيري فراوري شده با پروبيوتيك ها از اهميت زيادي در ارتقاء سلامت برخوردار مي باشند. در سال هاي اخير ميل به استفاده از باكتري هاي مفيدي به نام پروبيوتيك ها به عنوان يك رژيم كمكي در صنايع غذايي رو به رشد بوده است. باكتري هاي پروبيوتيك مورد استفاده در فراورده هاي رايج امروزه بيشتر گونه هاي مختلف جنس لاكتوباسيلوس و بيفيدوباكتريوم هستند. ما در این مقاله به بررسی پايداري شير پروبيوتيك تخميري و غير تخميري می‌پردازیم.

پروبیوتیک‌ها

پروبيوتيك ها در درمان و پيشگيري بيماري هايي نظير آلرژي، اسهال، عدم تحمل لاكتوز، عفونت دستگاه ادراري، عفونت با هليكو باكتر، سندروم روده تحريك پذير، التهاب روده و التهاب مزمن سينوس ها مؤثر مي باشند.

به منظور اثر بخشي پروبيوتيك ها براي انسان، تعداد ميكروارگانيسم هاي زنده بايد بيش از  log CFU/g  ۶باشد تا ميزان مناسب دوز روزانه  ۱۰۶-۱۰۹باكتري زنده را فراهم كند. باكتري هاي پروبيوتيك به صورت مكمل هاي غذايي يا فراورده هاي دارويي عرضه مي شوند. نتايج برخي تحقيقات نشان داده است كه بهترين تأثير زماني است كه اين باكتريها به فرآورده غذايي اضافه شوند.

شیر پر مصرف ترین فرآورده لبنی

يكي از پر مصرف ترين فراورده ها در سبد غذايي خانواده ها شير مي باشد كه علاوه بر ايجاد محيطي مناسب جهت رشد و بقاء پروبيوتيكها با داشتن خواص تغذيه اي خاص خود محصولي با ارزش را به مصرف كننده عرضه مي كند. ماست و شيرهاي پروبيوتيك به روش هاي مختلفي مانند اضافه كردن باكتري ها به شير تازه بدون انجام عمل تخمير مانند (sweet milk) يا تخمير شير توسط باكتري هاي پروبيوتيك مانند  (Yakult) توليد مي شوند . اضافه كردن پروبيوتيك ها به فراورده هاي شيري تخميري منجر به حفاظت شير با توليد اسيدلاكتيك و تركيبات ضد ميكروبي و افزايش ارزش تغذيه اي غذا با توليد تركيباتي مانند اسيد هاي آم ينه آزاد و ويتامين ها مي شود. در ميان لاكتوباسيلوس ها، لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس و لاكتوباسيلوس كازئي فلور نرمال روده ی انسان بوده و با محيط دستگاه گوارش سازگار مي باشند.

لاكتوباسيلوس پلانتاروم نيز باكتري تطابق پذيري است كه مي تواند در محيط هاي مختلفي مانند لبنيات، گوشت و بسياري از سبزيجات تخميري زندگي كند .

از آنجايي كه تاكنون مطالعه اي در خصوص تهيه شير پروبيوتيك با استفاده از شيرهاي توليد شده در ايران و همچنين سويه هاي لاكتوباسيلوس بومي ايران صورت نگرفته است، هدف از اين تحقيق توليد شير پروبيوتيك تخميري و غير تخميري (شيرين) با استفاده از گونه هاي مختلف جنس لاكتوباسيلوس شامل لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس، لاكتوباسيلوس كازئي و لاكتوباسيلوس پلانتاروم و بررسي برخي خصوصيات شير پروبيوتيك تهيه شده مانند تعداد باكتري هاي زنده و  pHآن بوده است.

مواد و روش ها

شير  UHTو پاستوريزه  %۲/۵ چربي از كارخانه پگاه تهران تهيه شدند. سه سويه لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس ،PTCC 1643 لاكتوباسيلوس كازئي ،PTCC 1608 لاكتوباسيلوس پلانتاروم  PTCC 1058از ذخيره ميكروبي آزمايشگاه تحقيقات پروبيوتيك دانشكده داروسازي دانشگاه علوم پزشكي تهران تهيه شدند. براي كشت و فعال سازي باكتري ها از محيط MRS CO2 %5  و۳۷ °C  و دماي MRS broth ياagar  استفاده گرديد.

۱-تعيين بار ميكروبي اوليه شير پاستوريزه و UHTبراي اين منظور با استفاده از آب مقطر استريل رقت هاي مختلف از نمونه شير تهيه گرديد و تعداد باكتري هاي زنده به روش شمارش در پليت تعيين شد.

براي شمارش لاكتوباسيلوس ها از محيط MRS agar )دماي  CO2 %5 ،۳۷ °C(به مدت  ۴۸ساعت) و ساير باكتري ها از محيط  Tryptic soy agarدماي  ،۳۷ °C(به مدت  ۴۸ساعت) استفاده گرديد.

هر آزمايش حداقل سه بار تكرار شد و نتايج به صورت ميانگين  CFU /mlشير بيان گرديد. تهيه شير پروبيوتيك غير تخميري (شيرين( كشت  ۲۴ساعته باكتري ها در محيط  MRS broth به طور جداگانه در دور  ۵۰۰۰× gبه مدت  ۱۵دقيقه سانتريفوژ گرديد. مايع رويي دور ريخته شد و سلول ها با آب مقطر استريل شستشو داده شد. عمل شستشو يك بار ديگر نيز تكرار گرديد. سپس سلول ها در حجم مناسبي از آب مقطر استريل سوسپانسيون شدند به طوري كه غلظتي معادل  ۱۰۹ CFU/mlايجاد شود.

سپس از اين سوسپانسيون به ميزان  %۱حجمي/حجمي به طور جداگانه به شير پاستوريزه و  UHTتلقيح گرديد. ظروف حاوي شير تلقيح شده به يخچال با دماي حدود  ۴°Cبراي مدت  ۱۴روز منتقل شدند. سپس هر ۲ روز تعداد باكتري هاي زنده موجود در شير به روش شمارش در پليت و تغييرات   pH با استفاده از دستگاه pH متر تعيين گرديد.

تهيه شير پروبيوتيك تخميري

– تعيين زمان بهينه گرمخانه گذاري براي تهيه شير پروبيوتيك تخميري براي اين منظور ابتدا از كشت  ۲۴ساعته باكتري هاي مورد آزمايش سوسپانسيوني با غلظت ۱۰۹ CFU/ml )مانند روش ذكر شده براي تهيه شير پروبيوتيك شيرين( تهيه گرديد. سپس اين سوسپانسيون تا غلظت  106CFU/mlرقيق گرديد. از اين سوسپانسيون به ميزان  %۱حجمي/ حجمي به طور جداگانه به شير پاستوريزه و UHTتلقيح شد. ظروف حاوي شير تلقيح شده به گرمخانه  ۳۷°Cداراي  CO2 %5منتقل شدند و تعداد باكتري هاي زنده و تغييرات   pHدر فواصل زماني مشخص تعيين گرديد.

بررسي پايداري شير پروبيوتيك تخميري در يخچال

پس از  ۱۰ساعت گرمخانه گذاري ظروف حاوي شير تلقيح شده با هر يك از باكتري هاي مورد آزمايش، نمونه ها به يخچال با دماي حدود  ۴°Cمنتقل شدند و تعداد باكتري هاي زنده و  pHآن ها در فواصل زماني مشخص تا  ۱۴روز تعيين گرديد.

تجزيه و تحليل آماري

محاسبات آماري با استفاده از آزمون ANOVA توسط نرم افزار   Design of Experimentو با روش General Factorial انجام شد و p < 0/01   به معني  وجود اختلاف معني دار بين داده ها در نظر گرفته شد.

يافته ها

در شير پاستوريزه حدود  ۱۰^۲ CFU/mlباكتري درمحیط MRS agar  و  ۱۰^۴ CFU /ml  باكتري در محيط Tryptic soy agar شمارش گرديد. در مورد شير  UHTهيچ گونه باكتري در محيط   MRS agarو Tryptic soy agar مشاهده نگرديد.

نتايج مربوط به تغييرات تعداد لاكتوباسيلوس هاي زنده در شير  UHTغير تخميري (شيرين) بررسی شد. در طي چهارده روز نگهداري در يخچال تعداد لاكتوباسيلوس پلانتاروم نسبت به تعداد اوليه افزايشي نشان نداده است  (۱۰۷ CFU /ml) اما تعداد لاكتوباسيلوس كازئي و لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس در روز چهارم  ۱سيكل لگاريتمي افزايش يافته و به  ۱۰۸ CFU /mlرسيده است، كه اين تعداد تا روز چهاردهم تقريباً ثابت باقي مانده است.

روند رشد باكتري ها در شير پاستوريزه شيرين مشابه شير UHTمي باشد. با اين تفاوت كه ميزان رشد در اين شير بيشتر بوده است. بعد از  ۱۴روز نگهداري در يخچال لاكتوباسيلوس پلانتاروم كمتر از  ۱سيكل لگاريتمي و لاكتوباسيلوس كازئي در حدود  ۱سيكل لگاريتمي افزايش رشد نشان دادند. لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس با  ۲سيكل لگاريتمي افزايش، بيشترين تعداد را نشان داد ) CFU .(109 /ml محاسبات آماري در مورد شير شيرين مشخص نمود نوع شير اثر معني داري بر قابليت زيستي لاكتوباسيلوس ها ميگذارد. همچنين اثر تداخل نوع شير و سويه لاكتوباسيلوس و اثر تداخل سويه لاكتوباسيلوس و زمان نيز معني دار بود.

تغييرات  pHشير UHTو پاستوريزه شيرين بررسی شد. طي  ۱۴روز نگهداري در يخچال،  pH شير  UHTتلقيح شده با هر سه سويه تغيير محسوسي نداشت و در حد  pHاوليه (۶/۴ ) باقي ماند.  pHشير پاستوريزه شيرين تلقيح شده با لاكتوباسيلوس پلانتاروم و لاكتوباسيلوس كازئي در طي  ۱۴روز نگهداري در يخچال، از مقدار اوليه  ۶/۴ به  ۵/۵ و با لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس به  ۵/۱رسيد.

محاسبات آماري نشان داد نوع شير اثر معني داري(  (p<0/0001بر تغييرات  pH ميگذارد. همچنين اثر تداخل نوع شير و سويه لاكتوباسيلوس و اثر تداخل سويه لاكتوباسيلوس و زمان نيز معني دار بود.

رشد لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس از ساعت دوم و رشد لاكتوباسيلوس كازئي و لاكتوباسيلوس پلانتاروم از ساعت چهارم آغاز گرديد. بعد از  ۲۴ساعت تعداد لاكتوباسيلوس پلانتاروم در حدود  ۳سيكل لگاريتمي  (۱۰۷ CFU /ml) و لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس و لاكتوباسيلوس كازئي ۴ سيكل لگاريتمي افزايش يافت (۱۰۸ CFU/ml).

بررسي تغييرات تعداد لاكتوباسيلوسهاي زنده در شير  UHTتخميري مشخص نمود كه رشد هر سه سويه از ساعت ششم آغاز گرديد. بعد از  ۲۴ساعت، لاكتوباسيلوس پلانتاروم و لاكتوباسيلوس كازئي در حدود ۳ سيكل لگاريتمي (107CFU/ml) و لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس در حدود  ۴سيكل لگاريتمي (CFU /ml 108 ) افزايش رشد نشان دادند. در ساعت  ۱۰گرمخانه گذاري تعداد باكتري ها به حدود  106CFU/ml كه حد قابل قبولي براي فراورده هاي پروبيوتيك مي باشد رسيد.

مطالعات آماري نشان داد نوع شير اثر معنيداري بر تعداد لاكتوباسيلوس هاي زنده مي گذارد. همچنين اثر تداخل نوع شير و سويه لاكتوباسيلوس و اثر تداخل سويه لاكتوباسيلوس و زمان نيز معني دار بود. pH شير پاستوريزه تخميري تهيه شده با لاكتوباسيلوس كازئي، لاكتوباسيلوس پلانتاروم و لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس پس از  ۲۴ساعت گرمخانه گذاري از ميزان اوليه  ۶/۴به ۴/۷ ،۵ و  ۴/۵كاهش يافت.

pHشير UHTتخميري تلقيح شده با لاكتوباسيلوس كازئي و لاكتوباسيلوس پلانتاروم در حد  pHاوليه  ۶/۴باقي ماند اما  pHشير تهيه شده با لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس تا  ۵/۷كاهش يافت. محاسبات آماري نشان داد نوع شير و تداخل سويه لاكتوباسيلوس و زمان اثر معني داري بر تغييرات  pH ميگذارد همچنين تداخل نوع شير و سويه لاكتوباسيلوس معني دار بود.

جداولی که بيانگر تغييرات تعداد باكتري هاي زنده در شير  UHTتخميري در مدت  ۱۴روز نگهداري در يخچال (۴°C ) بود بررسی شد. در طي اين مدت تعداد باكتريها با روندي آهسته افزايش يافت. رشد لاكتوباسيلوس كازئي و لاكتوباسيلوس پلانتاروم از روز چهارم آغاز شد و در پايان روز چهاردهم در حدود  ۱سيكل لگاريتمي افزايش نشان داد ( .(107CFU/mlرشد لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس با بيشترين افزايش از روز دوم آغاز شد و در روز چهاردهم ۲ سيكل لگاريتمي افزايش نشان داد (108CFU/ml).

pHشير  UHT تخميري در مدت نگهداري در يخچال تغييرات محسوسي نداشت و در پايان روز چهاردهم  pH شير تهيه شده با هر سه سويه در حد  pHاوليه  (۶/۴) باقي ماند. محاسبات آماري در مورد شير UHTتخميري نشان داد نوع سويه اثر معني داري بر قابليت زيستي لاكتوباسيلوس ها و تغييرات  pHمي گذارد. اثر تداخل سويه لاكتوباسيلوس و زمان نيز بر قابليت زيستي لاكتوباسيلوسها معني دار بود. در حالي كه اثر تداخل سويه و زمان بر تغييرات  pH معني دار نبود .

در رابطه با شير پاستوريزه تخميري از آنجا كه پس از انتقال به يخچال خواص ظاهري شير ً كاملا تغيير كرد و دلمه شد، از مطالعه خارج گرديد.

بحث

به منظور توسعه فراورده هاي پروبيوتيك بايد توجه خاصي به انتخاب سويه ها بر اساس معيار عملكردي و محيط پايه اعمال گردد، گاهي انتخاب نامناسب منجر به توليد محصولي نامطلوب مي شود. از اين رو در اين مطالعه سعي شد به منظور تهيه شير پروبيوتيك از شيرهاي توليد شده در ايران و هم چنين سويه هاي لاكتوباسيلوس بومي ايران استفاده گردد. نتايج اين تحقيق نشان داد لاكتوباسيلوس ها در شير UHTتخميري و غير تخميري و پاستوريزه غير تخميري در دماي يخچال  (۴°C) پايدار و فعال باقي ماندند وگاه روند رو به رشد داشتند. در طي نگهداري در يخچال،  pH شير  UHTتخميري و غير تخميري تلقيح شده با هر سه سويه به كندي و به ميزان بسيار كمي كاهش يافت ولي   pHشير پاستوريزه غير تخميري به ميزان بيشتري كاهش يافت كه آن را مي توان به بار ميكروبي ذاتي شير پاستوريزه نسبت داد.

Ronkaو همكاران نشان دادند   pHشير بدون چربي  (skim milk) تهيه شده با سويه هاي لاكتوباسيلوس برويس در مدت  ۲۰/۵ ساعت تخمير در دماي  ،۳۷°Cتغيير محسوسي نميكند .نتايج اين مطالعه نشان داد كه در مدت  ۲۴ساعت تخمير  pH شير UHT تخميري تهيه شده با لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس حداكثر تا حدود  ۵كاهش مي يابد، در حالي كه   pHشير پاستوريزه تخميري تهيه شده با لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس و لاكتوباسيلوس پلانتاروم تا حدود  ۴كاهش يافت.

Georgieva و همكاران بر روي شير تخمير شده با لاكتوباسيلوس پلانتاروم مطالعاتي انجام دادند. در اين تحقيق در حدود  106CFU/ml باكتري به شير بدون چربي (skim  milk) تلقيح شد. طي زمان تخمير تعداد باكتري ها  ۲سيكل لگاريتمي افزايش يافت و در زمان نگهداري در يخچال تا روز  ،۲۸حيات باكتري ها در حد مطلوبي حفظ شد و به حدود  ۱۰۷ CFU/mlرسيد، لذا شير تخميري حامل مناسبي براي سويه هاي لاكتوباسيلوس پلانتاروم در نظر گرفته شد كه مي تواند حاوي تعداد بالايي از سلول هاي زنده در فراورده نهايي در زمان مصرف باشد.

در اين مطالعه نيز تعداد لاكتوباسيلوس پلانتاروم در شير  UHTطي زمان تخمير ۲سيكل لگاريتمي افزايش يافت )(۱۰۶ CFU/ml) و در مدت نگهداري در يخچال نيز پايدار ماند و به  ۱۰۷ CFU/mlرسيد. نتايج اين تحقيق نشان داد كه علاوه بر لاكتوباسيلوس پلانتاروم، تعداد لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس و لاكتوباسيلوس كازئي نيز طي زمان تخمير در حد قابل قبولي افزايش مي يابد.

فاكتور هاي زيادي در شير تخميري شناسايي شده اند كه مي توانند بر حيات باكتري ها اثر بگذارند كه شامل pH و سطح اسيدي، حضور ساير ميكروارگانيسم ها، دماي گرمخانه گذاري و حضور اكسيژن است. طبق يافته Shah كاهش تعداد لاكتوباسيلوس ها در فراورده هاي پروبيوتيك احتمالاً به علت آسيب اسيد به ارگانيسم ها مي باشد.

Klaver و همكاران نيز نشان دادند كه علت رشد آهسته باكتري ها در حين تخمير مي تواند كمبود فعاليت پروتئوليتيكي آن ها باشد .

Samonaحداقل ميزان باكتري هاي پروبيوتيك بكار رفته در فراورده هاي پروبيوتيك را  ۱۰۶ CFU /mlبيان نمود .در اين مطالعه نيز تعداد باكتري هاي پروبيوتيك زنده موجود در شير پاستوريزه شيرين و  UHTتخميري و شيرين در طي  ۱۴روز نگهداري در يخچال در حد قابل قبول – ۱۰۹ CFU/ml  ۱۰۷گزارش گرديد.

در تحقيقي ديگر توسط   Ronkaو همكاران تغييرات تعداد۲ سويه متفاوت لاكتوباسيلوس برويس در شير شيرين در مدت  ۲۲روز نگهداري در يخچال سنجيده شد. در پايان اين مدت تعداد لاكتوباسيلوس برويس  GRL1در حد تلقيح اوليه باقي ماند، اما تعداد لاكتوباسيلوس برويس  GRL62در حد  ۱سيكل لگاريتمي كاهش يافت.

در اين مطالعه پس از  ۱۴روز نگهداري شير پاستوريزه و  UHTشيرين در يخچال تعداد لاكتوباسيلوس پلانتاروم در حد تلقيح اوليه ماند ((۱۰۷ CFU/mو تعداد لاكتوباسيلوس كازئي  ۱سيكل لگاريتمي افزايش يافت،(۱۰۸ CFU/ml) در حالي كه تعداد لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس در شير UHTشيرين ۱ سيكل لگاريتمي (۱۰۸ CFU/ml) و در شير پاستوريزه شيرين ۲سيكل لگاريتمي افزايش يافت (۱۰۹ CFU/ml).

در تحقيقات مختلف مشخص شده غذا رايج ترين سيستم حامل براي باكتري هاي پروبيوتيك مي باشد. به گونه اي كه تركيبات غذا باكتري هاي پروبيوتيك را از شرايط اسيدي حفاظت مي كنند و در نتيجه حيات آن ها را در محيط معده افزايش مي دهند. همچنين شير حيات سويه هاي بيفيدوباكتريوم و لاكتوباسيلوس حساس به اسيد را در طول عبور از شرايط شبه مجراي گوارشي افزايش مي دهد كه طبق نظر  Conwayو همكاران اين اثر حفاظتي ممكن است به علت افزايش  pHروده بعد از اضافه شدن شير باشد .نتايج اين مطالعه نشان داد كه شير مي تواند حامل مناسبي براي تهيه فراورده هاي پروبيوتيك باشد.

نتيجه گيري

نتايج اين مطالعه نشان داد كه شير پاستوريزه و شير  UHTمي تواند به عنوان محيط مناسبي براي تهيه شير پروبيوتيك غير تخميري با استفاده از سه سويه لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس، لاكتوباسيلوس كازئي و لاكتوباسيلوس پلانتاروم استفاده گردد. شير  UHTبا توجه به عاري بودن از هر گونه ميكروارگانيسم مي تواند به عنوان محيط مناسبي براي تهيه شير پروبيوتيك تخميري نيز استفاده گردد. علت پايداري شير پروبيوتيك در مقايسه با شير معمولي را ميتوان به توليد اسيدلاكتيك و تركيبات ضد ميكروبي توسط لاكتوباسيلوس ها نسبت داد كه منجر به حفاظت شير مي شود.

مطالب مرتبط: