آنزیم لاکتو پراکسیداز استخراج شده از شیر شتر توسط آلژینات سدیم

۲۴ تیر, ۱۴۰۱

آنزیم لاکتو پراکسیداز استخراج شده از شیر شتر توسط آلژینات سدیم

در این تحقیق به نحوه ی خالص سازی و تثبیت آنزیم لاکتو پراکسیداز استخراج شده از شیر شتر توسط آلژینات سدیم می پردازیم.

مقدمه

شــیر شــتر با دارا بودن بیواکتیوها نظیر لاکتوفرین و لاکتو پراکســیداز و برخی ترکیبات خاص نظیر پروتئین اســیدی آب پنیــر( Whey Acidic Protein (WAPو پپتیدهای شــبه انسولینی همچنین بدلیل فقدان بتا دو لاکتوگلوبولین می تواند بعنوان غذای فراســودمند محســوب گردد. شیر شتر دارای بیو اکتیوهایی اســت که هر کدام به نوبه خود بســیار بــا ارزش بــوده و عملکرد بیولوژیکــی خاصی دارند.

لاکتو پراکســیداز چیست؟

لاکتو پراکســیداز بیو اکتیوی اســت بــا کارایی ضد میکروبی که بعنــوان نگهدارنده طبیعی کاربرد زیادی دارد. لاکتوپراکســیداز پلی پپتیدی با   ۶۱۲اسید آمینه و وزن ملکولی حدوداً  ۷۸KD بوده که نقطه ایزوالکتریک آن برابر  ۹/۶می باشــد.

لاکتو پراکســیداز از آنزیم های مقاوم به حرارت است که به عنوان شاخص پاستوریزاســیون محســوب می گردد دارای یک گروه هــم (آهن) و حدود  %۱۰کربوهیدرات می باشــد. سیستم ضد میکروبی لاکتوپراکسیداز، با افزایش دو ترکیب فعال کننده تیوســیانات و پراکســید هیدروژن اعمال میگردد.

لاکتوپراکسیداز، تیوسیانات را در حضور پراکسید هیدروژن اکسید میکند و به این ترتیب هیپوتیوسیانات با خاصیت ضدمیکروبی قوی تولید می گردد، این ترکیب با  SH پروتئین های باکتریایی پیوند برقرار کرده و اثر بازدارندگــی خود را بر ویروس ها، قارچ ها و باکتری ها اعمال می نماید.

مقایسه توالی اسیدهای آمینه آنزیم لاکتو پراکسیداز انسان با لاکتو پراکسیداز گاو، گاومیش، گوسفند، بز و شیر شتر نشان داد که تشابهی حدوداً  %۸۵ وجود دارد واین در حالی اســت که این مقایســه در بین حیوانات به استثنای شتر نشان می دهد که بین  ۹۵تا  %۹۸تشابه وجود دارد بنابراین لاکتو پراکسیداز شیر شتر با سایر حیوانات تفاوت دارد.

شیر شتر و اثر محرومیت از آب

شیر شتر و اثر محرومیت از آب

افزایش کارائی آنزیم ها

جهت افزایش کارائی آنزیم ها از تکنیک تثبیت آنها استفاده می کنند. دو مزیت اصلی تثبیت آنزیم جداســازی آســان از محصولات و اســتفاده مجدد از آنزیم می باشــد. بطور کلی از سه روش اتصال با حامل (-Cross Cross-linking)، تثبیت با اتصال پل های عرضی (linking method method) و بــدام انداختــن ( Entrapping method) می تــوان برای تثبیت آنزیم ها استفاده نمود. انکپسوله کردن لاکتوپ راکسیداز توسط آلژینات، روش سوم تثبیت آنزیم ها می باشد. آلژینات یک صمغ هترو پلی ساکارید خطی است که در دیواره سلولی و فضای بین سلولی جلبک قهوه ای یافت می شود و قابلیت انعطاف و استحکام ساختمانی را برای گیاه فراهم می کند.

از نقطه نظر ســاختمانی آلژینات ها از واحدهای اســید – مانورونیک (M) و اسید – Lگلوکونیک ( G) تشکیل شده اند که از طریق پیوندهای گلیکوزیدی به یکدیگر متصل شــده اند آلژینات یک بیو پلیمر ارزان، در دسترس و غیرٔ سمی و موثر در حذف آلاینده ها از محیط آبی می باشد. این بیو پلیمر بدلیل داشتن ویژگی های چون تجزیه پذیری زیستی، خصوصیات هیدروفیلیکی و ماهیت طبیعی بیشتر مورد توجه قرار گرفته و از آن در جهت حذف رنگ و برخی فلزات سنگین استفاده شده است. بدلیل اهمیت ضد باکتریایی لاکتوپراکسیداز استفاده از آن بعنوان نگهدارنده طبیعی موارد غذایی مطرح می باشــد. لذا جهت نگهــداری و فعالیت بهینه آنزیم انکپســوله کردن آن می تواند حائز اهمیت باشد.

مواد و روش کار

مواد مورد اســتفاده:

شیر شــتر از شتر تک کوهانه بوم شناخت ترکمن(اســتان گلستان،) مواد تترا متیل بنزیدین (از شــرکت AppliChem ) آلژینات کلسیم (از شرکت  Fluka) کلرید سدیم ، کلرید کلسیم ، سولفات آمونیوم، پراکســید هیدروژن  ،%۳ گلیسرین، دی متیل سولفوکساید، اسید کلریدریک، توئین ،۸۰تریس، گلیسین، آمونیوم پرسولفات، سدیم دودسیل سولفات، نیترات نقره، کربنات سدیم، متانول و از شرکت مرک آلمان تهیه شــدند. آلبومین سرم گاو، ســفادکس- ، ۵۰ Cسفادکس  ،۱۰۰-Gآکریل آمید، بیس آکریل آمید ازشرکت سیگما آلدریچ تهیه شدند.

اســتخراج و خالص ســازی آنزیــم لاکتو پراکســیداز:

در این تحقیق لاکتوپراکسیدازی براساس روش تغییر یافته، از شیر شتر بوم شناخت ترکمن استخراج، خالص سازی گردید. بطور خلاصه پس از چربی زدادیی وجدا سازی کازئین از آب پنیر و صاف کردن به منظور کروماتوگرافی تعویض یونی از رزین ســفادکس ســی (CM sephadex C-50( 50 و ستونی به ابعاد ( ۱۰× ۳ cm) و برای ژل فیلتراســیون از ســفادکس  ۱۰۰ -Gاستفاده گردید. عمل متعادل ســازی با بافر فسفات ســدیم  ۱۰mMبا ( pH=6/8 ) انجام گرفت. در کروماتو گرافی تعویض یونی جمع آوری فراکســیون های حاوی پروتئین های با شستشــو توسط بافر فســفات سدیم محتوی مقادیر مختلف کلرید ســدیم ( ۰/۲ Mتا  ) انجام شــد. میزان خلوص پروتئین در فراکســیون های جمع آوری شــده به روش  SDS- PAGE بررسی گردید.

از رنــگ آمیزی نیترات نقره برای دیــدن باند حاوی پروتئین در ژل آکریل آمیــد  ٔ %۱۲/۵اســتفاده گردید. به منظور تایید وجود لاکتوپراکســیداز از در فراکسیون ها، از آزمایش واکنش رنگی لاکتو پراکسیداز با تترا متیل بنزیدین ( TMB) استفاده شد.

ســنجش فعالیت و بررسی ســنتیک آنزیم لاکتو پراکسیداز:

سنجش فعالیت آنزیم براساس روش تغییر یافته ( )۴انجام گرفت. لاکتوپراکسیداز در (tetramethylbenzidine-_5 ,5 ,_3 ,3) حضورپراکســید هیدروژن بار  TMB واکنش رنگی نشــان ایجاد می نماید. برای انجام آزمایش مقدار ،۱mlر ۲ TMBmmolبه مقدار  ۳۰۰µl نمونه اضافه شــد. با اضافه کردن مقــدار  ۵۰۰µlپ راکســید هیــدروژن (۰.۳mMا- )H2O2 شــرایط انجام واکنــش فراهم می گــردد. پس از  ۵دقیقه انکوباســیون در  ۳۷oC با اضافه کردن مقدار  ۵۰۰µl اسیدســولفوریک  ۲N واکنش متوقف شده، پس از ۱۰ دقیقه انکوباسیون در این شرایط جذب در طول موج  ۴۵۰nm اندازهگیری  به عنوانHRP )Horseradish Peroxidase) شد. در این ســنجش از کنترل مثبت استفاده گردید. یک واحد ( ۱ ) Uفعالیت آنزیم لاکتوپراکسیداز، مقــدار آنزیمی اســت کــه اکسیداســیون  ۱µmol/minاز سوبســترای تترامتیــل بنزیدین را در دمــای  ۲۵oC و  ۶ pHدر محصول رنگی (cm-1  )ε= ۵۹۰۰۰ M-1 کاتالیز می کند. جهت بررســی سنتیک فعالیت آنزیم از غلظتهای مختلــف ( ۰/۱mMتا )۲/۵ا ،TMBدر برابر مقدار مشــخص آنزیم ( ۵۰µgآنزیم) استفاده گردید. سنتیکی آنزیم Km, Vmax فعالیت آنزیم در برابر غلظت های مختلف TMBسنجش شد.

تهیه محلول لاکتو پراکسیداز -آلژینات:

لاکتوپراکسیداز درحجم نهایی  %۰/۲و نیز آلژینات سدیم در حجم نهایی %۰/۲ استفاده گردید. بدین منظور لاکتو پراکســیداز محلول در بافر فســفات  ۲۰۰mM با  ۶/۵PHبتدریج در دمای محیط به محلول آلژینات افزوده و با همزدن در شــرایط (۸۵۰rpm – بمدت ۳۰دقیقه و درجه حرارت ) ۲۵oCمحلول لاکتو پراکسیداز – آلژینات تهیه گردید.

تهیه محلول گلیســرول-توئین  :

۸۰برای تهیه میزان  %۲۵حجمی/ حجمی گلیســرول و W/W %4توئین (بعنوان سورفاکتانت) مخلوط و به مدت  ۱۵دقیقه با اســتفاده از حرارت مرطوب تا  ۷۰ oCحرارت داده شــد و جهت استفاده، دمای محلول به دمای اتاق رسانیده شد.

تهیــه امولســیون:

برای تهیه امولســیون ،محلول لاکتوپرکســیداز- آلژینات تهیه شده با استفاده از همزن مغناطیسی هم زده شده (rpm-750- درجه حرارت  )۲۵ oC به تدریج به محلول گلیسرول-توئین  ۸۰افزوده و در شرایط (  – rpm-950درجه حرارت  ۴۵ – ۲۵ oCدقیقه) هم زده شد.

تثبیــت توســط یــون کلســیم یــک درصد: محلــول کلرید کلســیم ( CaCl2.6H2O) بــا غلظــت یــک درصد  W/V تهیه وبــه آرامی (قطره قطره) داخل  ۱۰۰ml امولســیون چکانده شد. بعداز مدت  ۴۵دقیقه (-۹۵۰ – rpmدرجــه حرارت  ) ۲۵ oCکه محلول حاصل هم زده شــد،  ۶۰دقیقه فرصت داده می شود تا کپسول های آلژینات کلسیم در کف رسوب نمایند، بعد از صاف کردن کپسولها با اتانل شستشو داده شدند. سپس کپسولها توســط سانتریفوژ ( ۱۵۰۰ rpm) بمدت  ۱۰دقیقه جمع آوری شدند. در آخر کپسول ها تهیه شده سه بار با سرم فیزیولوژی شستو وتا قبل از استفاده در دمای  ۴ oCنگهداری شدند.

بررســی کارآئی ریز پوشــانی:

مقدارلاکتوپراکســیداز قبــل و پس از انکپسوله شــدن بااســتفاده از روش برادفورد، اندازهگیری شد. جذب تمام نمونه ها در طول موج  ۵۹۵nm با اســتفاده از دســتگاه اســپکتروفتومتری  اندازهگیری شــد Japan-28D96741-160A-SHIMADZU-uv از آنجایــی که در ایــن روش جهت تعیین مقدار پروتئین، آلژینات کلســیم تداخل نموده و دارای جذب می باشــد، در تعیین مقدار،جذب یک محلول از کپسول آلژینات بدون لاکتوفرین با غلظت مشابه (شاهد) نیز خواند می شود.و جذب شاهد از جذب محلول نهایی پس از انکپسوله شدن کسر می گردد.برای محاسبه بازده مقادیر پروتئین موجود در محلول اولیه (قبل از تشکیل محلول) و میزان پروتئین باقی مانده در محلول ناشی از شتشوی نهایی در نمونه و شاهد اندازه گیری گردید. جهت افزایش صحت و دقت آزمایش سه تکرا شد. جهت محاسبه کارآئی ریز پوشانی از معادله  زیر استفاده گردید.

E% = C-1 C0/C100 × ۱

در ایــن معادلــه  E کارآئی ریز پوشــانی لاکتوفریــن،  C1و  C0 مقدار پروتئین موجود در محلول قبل و بعد از فرآیند انکپســوله کردن بر حســب میکروگرم در میلی لیتر می باشد.

تعیین اندازه ذرات و نحوه پراکنش آنها:

اندازه کپســول ها و فراوانی هریک ازآنها با استفاده از دستگاه اندازه گیری قطر ذرات (Particle Size) تعییــن SALD-2101 SHIMADZU (Japan ) مــدلAnalyser گردید. بدین منظور کپسول ها در آب یون زدایی شده (Milli Q Millipore )USA با ضریــب هدایــت  ۰/۰۵۴ µs پراکنده و نتایج براســاس قطر حجم میانگین گزارش گردید.

تعیین مرفولوژی ذرات و مشاهده ریز ساختار تشکیل شده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی:

VP Germany 1450 LEOجهت تعیین مرفولوژی ذرات و مشاهده شکل ظاهری نانوکپسول های ایجاد شده از میکروســکوپ  SEM استفاده گردید. استاب نمونه ها پس از آماده سازی و پوشش به اتاقک نمونه تحت خلاء منتقل شدند. مشاهده کپسول ها بوسیله تابش الکترونی با ولتاژ ۲۰Kv انجام گرفت و تصویر بر اساس شعاع الکترونی برگشتی از نمونه ها بدست آمد. بدین منظور پس از آماده سازی کپسول های شسته شده در مرحله نهایی توسط سرم فیزیولوژی همراه W/W %0/09 گلیســرول استریل دو بار (ســانتریفوژ  ۱۰ ،۱۰۰۰ rpmدقیقه) و در مرحله آخر شست شو با آب مقطر فاقد یون استریل دو بار انجام گرفت سپس تثبیت ذرات با گلوتارالدئید %۲ انجام گرفت.

نمونه ها بر روی یک استاب آلومنیومی ( SC 7620 England) پوشــیده شــده با لایه ای از کربن به قطر ۱۲mm پخش و بوسیله یک لایه نازک رسانا از جنس طلا و پالادیم بمدت پوشش داده شدند.

بررسی پایداری آنزیم لاکتو پراکسیداز محلول و انکپسوله در زمان های مختلف:

بدین منظور محلول لاکتو پراکســیداز و لاکتو پراکسیداز انکپسوله بمدت  ۷۰روز در دمای  ۴ oC گردید طی این مدت با فاصله زمانی  ۱۰روز، فعالیت آنزیم لاکتو پراکسیداز در هر دو محلول با استفاده از واکنش رنگی با TMBمورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج

نتایــج حاصــل از خالص ســازی لاکتو پراکســیداز: نتایــج حاصل از ســنجش پروتئین در فراکشن ها استخراج شده با استفاده از کروماتوگرافی ژل فیلتراســیون برروی ســفادکس  ( ۱۰۰-G) نشــان داد که در می توان از فراکســیون های  ۱۸تا  ۳۸برای انجام مراحل بعد استفاده نمود.

نتایج حاصــل از  SDS_PAGE و نیز واکنش رنگی با TMBخالص بودن لاکتو پراکســیداز را در فراکسیون های جمع آوری شده با غلظت نمکی M  ۰/۸و  ۰/۹نشان داد همچنین غلظتی معادل  ۰/۲۸ µg/mlبرای هر یک از فراکسیون ها بدست آمد.

نتایج حاصل از تعیین  pH اپتیمم فعالیت لاکتو پراکسیداز نشان داد که بیشترین فعالیت آن در حضور بافر فسفات سدیم با  ۶ pH می باشد.

نتایــج حاصــل از ســنجش فعالیت و بررســی ســنتیک آنزیــم لاکتو پراکســیداز:

مقــدار  Vmaxو  Km بــرای آنزیم محلول بــه ترتیب -ml 0/1µmol045-1min و- ۰/۱mM57و برای آنزیم بدست آمد. نتایج حاصل از تعیین  pH اپتیمم فعالیت لاکتو پراکسیداز نشان داد که بیشــترین فعالیت آن در حضور بافر فســفات ســدیم  ۱۰۰ mM و ۶ pH می باشد.

نتایج حاصل از انکپسوله کردن لاکتو پراکسیداز:

بررسی نتایج حاصل از تشکیل میکروکپسولهاو نتایج حاصل از کارآئی ریز پوشانی و مدت زمان نگهداری آنزیم بیان کننده این مطلب است که روش مورد استفاده روشی مناسب بوده و توانسته است کپسول هایی با اندازه ذرات کمتر از ۲۰۰ mic ایجاد نماید.

نتایج حاصل از کارآئی ریز پوشانی نشان داد که بازده  %۸۴ می باشد. تعیین مرفولوژی ذرات و مشاهده ریز ساختار تشکیل شده با استفاده از میکروسکوپ (SEM) نتایج نشان داد که قطر کپسول های تشکیل شده کمتر از  ،۲۰۰µm ســطح کپسول ً ها نســبتا صاف، با بهم چسبیدگی کم و ً دارای شــکلی نسبتا کروی می باشــند. با توجه به نتایج به دست آمده از آزمایشــات می توان نتیجه گرفت که پلیمر آلژینات حاملی مناسب برای تثبیت آنزیم لاکتو پراکسیداز می باشد.

زیرا آلژینات یک پلیمرطبیعی اســت که فاقد هرگونه مواد سمی می ٔ باشد و تاثیری بر روی ساختار آنزیم ندارد. تثبیت آنزیم اجازه اســتفاده مکرر از آنزیم و جداســازی راحت آنرا از محیط واکنش، داد. فعالیت آنزیم انکپسوله شده در  ۶ PH به حداکثر رسید.

آزمایش ها نشان داد که این بیوکاتالیست تثبیت شده با آلژینات سدیم تا۷۰ روز پس از نگهداری در  ۴ oC توانسته است  %۸۱ فعالیت خود را حفظ نماید در این در حالی است که با این شرایط تنها  %۲۰ فعالیت آنزیم بدون تثبت شدن، حفظ شده است.

بحث

شــیر شــتر در نقاطــی از دنیــا دارای اهمیت اقتصادی زیادی اســت. بیو اکتیوهای شیر شتر نظیر لاکتوفرین و لاکتو پراکسیداز و ایمونوگلوبولین ها به میزان قابل توجهی در قســمت آب پنیری شیر شتر یافت می شوند. فدراسیون جهانی محصولات لبنی توصیه می کند که از سیستم LPOS برای نگهداری شــیر خام به منظــور افزایش کیفیت حمل و نقل و بــرای کنترل باکتریایی بیماری زای ایجاد کننده اســپور در شیر شتر پاســتوریزه استفاده شود. همچنین اســتفاده از این سیســتم برای افزایش کیفیت فرمولاســیون شیر خشک کودکان، آب میوه، آب سبزیجات بسته بندی گوشت نیز توصیه شده است. اســتفاده از این سیستم هیچگونه اثر منفی بر روی خواص ارگانو لپتیکی و خواص فیزیکو شیمیایی مواد غذایی ایجاد نمی نماید. انکپسوله کردن آنزیم روشی برای افزایش کارآئی آن می شد.

در ایــن مطالعه که در نوع خــود برای اولین بار انجام می گیرد، جهت خالص سازی لاکتو پراکسیداز از روش کروماتوگرافی تبادل یونی با استفاده از رزین کربوکسی متیل سفادکس C-50 و نیز کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون با ستون ســفادکس  ۱۰۰ -Gاســتفاده گردید. گروه های کربوکسی متیل (CMا Carboxy Methyl) دارای بار منفی می باشند که به پروتئین با بار مثبت متصل می شوند.

از آنجا ئیکه لاکتو پراکسیداز دارای بار مثبت است به این رزین متصل شده و در غلظت های مختلف نمکی می توان این اتصال را جدا نمود. از سایر روش ها کروماتو گرافی تمایل یونی توسط آگارز هپارین  و نیز روشهایheparin-)agarose affinity chromatography) ژل فیلتراســیون ( gel filtration) کروماتوکرافی تبادل یونی و ســپس استفاده از ژل فیلتراسیون نیز برای خالص سازی لاکتو پراکسیداز می توان اســتفاده نمود.  Elagamyandو  Ruppanne در ســال  ۱۹۹۹ از روش تبادل یونی توســط کربوکسی متیل سلولز جهت خالص سازی لاکتوفرین و لاکتو پراکسیداز از شیر شتر استفاده کرد هاند .آنها از گرایان های ۰-۱ M کلرید سدیم برای جداسازی لاکتوفرین استفاده کردند(Kinkadeand.) و  kendarmiller در ســال ۱۹۷۶ از کربوکســی متیل ســفادکس برای خالص سازی لاکتو پراکســیداز استفاده نموده و نتایج خوبی بدست آوردند.

( Bolori Moghaddam ) و همکاران در ســال  ۲۰۱۲ با اســتفاده از کروماتوگرافی تبادل یونی با اســتفاده از رزین کربوکســی متیل سفادکس  ۵۰-Cو نیز کروماتوگرافی ژل فیلتراســیون با ســتون سفادکس لاکتوپراکسیداز شیر شتر را خالص نمودند که با نتایج این تحقیق همخوانی دارد. ایــن محققیــن پس از خالص ســازی اثر لاکتو پراکســیداز را بر روی باکتری استافیلو کوکوس اورئوس مورد بررسی قرار دادند.

نتایــج تحقیق حاضر با نتایــج این محققین هم خوانــی دارد. پس از خالص ســازی ســنتیک فعالیت آنزیم ( Km,Vmax) در برابر غلظت های مختلف  TMB سنجش شد. کیلومتر یک آنزیم، نشان دهنده تمایل آنزیم به سوبستر است. بدیهی است هرچه کیلومتر یک آنزیم کوچکتر باشد، این آنزیم به غلظت کمتر سوبســترا در محلول حساستر است. و همینطو ر از این طریق می توان به وجود سوبسترای مناسب برای هر آنزیم پی برد.

آلژینات سدیم

آنزیم لاکتو پراکسیداز استخراج شده با استفاده از آلژینات سدیم، گلیسرول وتوئین  ۸۰ انکپســوله گردید. امکان تثبیت آنزیم ها با حامل های مختلف توسط روش های، مختلفی صورت می ً گیرد. معمولا ارجحیت با روشی است کــه کمترین صدمه را به آنزیم وارد مین ماید و در این میان سیســتم هایی با ســهولت و امنیت بیشتر و هزینه کمتر ایده آل می باشند.

تثبیت آنزیم

در تثبیت آنزیم ها، پلیمر مورد استفاده می بایست غیر سمی باشد و پلیمرهای طبیعی از این نظر مناسب ترند. علاوه بر آن طبیعی بودن منبع تهیه این پلیمرها، امکان دستیابی به آنها را راحت تر می کند یکی از پلیمرهای طبیعی که برای عمل تثبیت آنزیم مناسب می باشد آلژینات است. نتایج بدست آمده از تحقیق حاضر نشان داد که از آلژینات که کربوهیدراتی مناسب برای استفاده در سیستم های بیولووژیک است می توان بخوبی برای تثبیت آنزیم لاکتو پراکسیداز استفاده نمود. از آلژینات برای تثبیت آنزیم های دیگر نیز استفاده شــده اســت. آلژینات خواصی مانند قوام دهندگی، تعلیق، تشــکیل فیلــم، تثبیت، تولید ژل و پایدارســازی امولســیون را دارد (در این تحقیق همچنین جهت ایجاد استحکام بهتر کپســولهای تشکیل شده از کلرید کلسیم استفاده شد تا پیوند متقاطع القا شود.

( Olivas ) و همکاران در سال  ۲۰۰۸ اعتقاد دارند که فیلم های آبدوست آلژینات، عایق ضعیف رطوبت هستند اما استفاده از کلسیم در فرمول، نفوذپذیری به بخار آب این فیلم هــا را کاهش داده و آنها را در آب نامحلول می ســازد. همچنین در مطالعه حاضر جهت بهبود خواص فیزیکی کپسول های تشکیل شده از گلیسرول و توئین  ۸۰استفاده گردید. نرم کننده ها (پلاستی سایزرها) جهت اصلاح خواص فیزیکی و مکانیکی به کار رفته و موجب کاهش شکنندگی، پیوندهای هیدروژنی بین زنجیره های پلیمر و افزایش فضاهای بین ملکولی آنها می شــوند.

نتایج حاصل از بازده تشــکیل کپسول هایی با سطح ً نسبتا صاف، شکلی کروی و بهم چسبیدگی کم و نگهداری آنزیم در طول زمان نشــان داد که از این روش بخوبی می توان برای انکپســوله نمودن و  تثبیت آنزیم لاکتوپراکســیداز استفاده نمود.

Yeو همکاران در سال ۲۰۰۰ برای تهیه پوشش های ضد باکتریایی به منظور استفاده در بسته بندی گوشت قرمز،گوشت مرغ و ماهی از لاکتو پراکسیداز تثبیت شده بر روی فیلم آلژینات استفاده نمودند ( Jafary ) و همکاران در سال  ۲۰۱۳ از پلمر پلی آلانین که توسط گلوتارآلدئید فعال شــده بود برای تثبیت آنزیم لاکتو پراکسیداز اســتفاده نمودند. در این روش میزان بــازده را  %۹۱ برآورد نموده همچنین آنزیم پس از  ۶۰ روز بعد از تثبیت توانســته است  %۸۰ کارآئی خود را حفظ نماید. در مقایسه این تحقیق با مطالعه انجام گرفته، بازده  %۸۴ و آنزیم تا ۷۰ روز پس از نگهداری در  ۴oC توانسته است  %۸۱ فعالیت خود را حفظ نماید تصویر  Miroliaei ) و همکاران در سال  ۲۰۰۷ از کونکاناوالین A همراه با سفارز۴Bا(۴Bا )CCon A-Sepharoseبرای تثبیت آنزیم لاکتو پراکسیداز استفاده نموده اند این محققین نشان دادند که با استفاده از روش یاد شده پس از  ۱۴روز در دمای  %۶۰، ۴ oCاز کارآئی آنزیم حفظ شده است.

به طورکلی با انجام این مطالعه نتیجه گرفته می شود که روش انکپسوله کردن آنزیم لاکتو پراکســیداز توسط آلژینات سدیم را میت وان یک روش سریع و ارزان و کاربردی دانســت که بدون نیاز به تجهیزات پیچیده آزمایشگاهی قابل انجام می باشد. این روش منجر به تسهیل و افزایش کاربرد آنزیم و نیز کاهش زمان انجام فرآیند تثبیت شده ، امکان استفاده چندین باره از آنزیم و افزایش قابل توجه در ماندگاری آنزیم را فراهم می آورد.

اشتراک در تلگرام
Cresta Help Chat
Send via WhatsApp