لاکتوفرین شیر گاو؛ پروتئین شگفت انگیزی که نمی‌شناسید!

آیا شما می دانید لاکتوفرین شیر گاو چیست؟ و چه کاربرد‌هایی دارد؟ در این مقاله به این سوالات و به نحوه ی جداسازی و خالص سازی لاکتوفرین از شیر گاو می پردازیم.

لاکتوفرین چیست؟

لاکتوفرین یک گلیکوپروتئین با وزن مولکـولی ۸۰ کیلو دالتون است کـه تمایـل زیـادی بـه اتـصال بـا آهـن دارد. لاکتــوفرین عــضوی از خــانواده ترانــسفرین‌هــا و وابسته به پروتئین‌هایی است که توانـایی اتـصال و انتقـال آهن را دارا می باشد. نام لاکتوفرین از طبقه بندی قدیمی آن به عنوان یک پـروتئین مهـم متـصل شـونده بـه آهـن مــشتق شــده اســت. لاکتــوفرین بیــشتر بــه عنــوان لاکتوترنسفـرین شناختـه می‌شود. درصد از توالـیلاکتوفرین و ترانسفرین مشابه یکدیگر است و بـه همـین دلیــل لاکتــوفرین بــه عنــوان عــضوی از ایــن خــانواده طبقه‌بندی می‌شود این پروتئین در اکثـر ترشـحات از جمله شیر، اشک، بزاق و همـینطـور بـه میـزان زیـاد در گرانول‌های اختصاصی نوتروفیـل‌هـا یافـت مـی‌شـود.

خــواص بیولــوژیکی لاکتوفرین شیر گاو چیست؟

خــواص بیولــوژیکی لاکتوفرین شــامل تنظــیم جــذب آهــن در روده، محرک رشـد سـلولهـای حیـوانی، خـواص ضـد التهابی، تعدیل کننده فعالیت سیستم ایمنی بدن و فعالیت ضـد باکتریـایی ویروسـی و تومـوری مـی‌باشـد. لاکتوفرین به عنوان جزئی از سیستم ایمنی ذاتـی معرفـی شــده اســت و در عــین حــال در واکــنش‌هــای ایمنــی اختصاصی نیز به طور غیر مستقیم دخالت می‌کنـد. بـه علت موقعیت استراتژیک لاکتـوفرین در سـطح مخـاط، یکی از اولین سیستم‌های دفاعی است که از ورود عوامل تهاجمی میکروبـی از راه مخـاط جلـوگیری مـی‌کنـد.

لاکتوفرین بر روی رشد و تکثیر عوامل عفـونی مختلـف مانند باکتری‌های گرم منفـی، گـرم مثبـت، تـک یاختـه، ویروس، انگل و قارچ‌ها تاثیر می‌گذارد. لاکتـوفرین با جذب آهن آزاد محیط را عاری از این عنصر می‌کنـد و در نتیجه باکتری‌ها و پـاتوژن‌هـایی کـه بـرای زنـدگی رشـد و تکثیـر خـود بـه آهـن نیـاز دارنـد از آن محـروم می‌مانند و قادر به ادامه زندگی نمی‌شوند و بدین ترتیـب لاکتوفرین به طور غیرمستقیم عفونت را مهار می‌کند.

لاکتوفرین از یک رشته پلـی پپتیـدی بـه طـول ۶۸۹ اسید آمینه تشکیل شده است. ساختمان پروتئینـی آن شامل دو بخش(  (lobe آمینـی(  (N-lobeوکربوکـسیلی (  (c-lobeاست. که هر کدام قابلیت اتـصال بـه آهـن آزاد را دارا می‌باشند. در واقـع لاکتـوفرین یـک آنتی‌اکسیدان است که آهن‌های آزاد را جـستجو و اخـذ می‌کند و مانع واکنش‌های رادیکال‌های آزاد می‌شود.

در یک کارآزمـایی بـالینی در مـورد مـصرف خـوراکی لاکتوفرین در هموستاز آهن زنان بـاردار نـشان داده شـد که لاکتوفرین کمبود آهن و کم خونی حاصل از کـاهش آهن را جبران می‌کند. تحقیقات پایه صورت گرفتـه در مــورد لاکتــوفرین، اهمیــت شــیر مــادر و ســودمندی وجــود لاکتــوفرین در فرمــول غــذایی کودکــان را نــشان می‌دهد. شواهد دیگری کـه تعیـین کننـده سـودمندی لاکتوفرین در فرمول غذایی می‌باشد از جمله بهبود فلور طبیعــی روده، افــزایش فــریتین ســرم، افــزایش ســطح هماتوکریـت و کـاهش بیمـاری‌هـای تنفـسی مـی‌باشـد.

عـلاوه بـر ایـن لاکتـوفرین مـانع اکـسیداسیون لیپیـد در فرمول غذایی کودکان می‌شود. ایـن پـروتئین بـا اثـر ممانعت شیمیایی موجب مهار رشد سـلول‌هـای سـرطانی در حلق، ریه، زبان، مثانه و کبد گـشته اسـت. اثـرات ممانعتی رشد سلول‌های سرطان کولون در تغدیـه رتهـا با لاکتوفرین مشخص شده است. به طوریکـه لاکتـوفرین و لاکتوفریــسین اثــرات ضــد متاســتاز نیــز دارنــد.

چرا خالص سازی لاکتوفرین شیر گاو

متابولیسم و مکانیسم عمل درمان با لاکتوفرین خـوراکی تحقیق شده و نشان داد که لاکتوفرین خوراکی بـه طـور کامل در مجرای گوارشی تجزیه نمی‌شود و بـه صـورت پپتید لاکتوفریسین باقی می‌ماند که به طور معمول جذب خــون نمــی‌شــود امــا بــر سیــستم ایمنــی روده و سیــستم محافظتی سیستمیک اثر می‌گذارد. با توجه به ارزش پروتئین خوراکی-دارویی لاکتوفرین، گـستردگی اثـرات تنظیم کنندگی سیستم ایمنی توسط آن، همچنـین ارزش خالص‌سازی لاکتوفرین و استفاده جهانی آن سبب شـده کـه مطالعـات گـسترده در مـورد ایـن پـروتئین صـورت گیـرد. بنـابراین خـالص‌سـازی پــروتئین فـوق در مطالعـه حاضر، فرصتی برای بدسـت آوردن کاربردهـای جدیـد لاکتوفرین علاوه بر انجام مطالعات ضد میکروبی و ضـد سرطانی آن در حوزه پزشکی خواهد بود. نتیجـه حاصـل از این تحقیق این است که پروتئین خالص شده به لحـاظ خلوص و غلظـت، متناسـب کـاربرد در تـست هـای ضـد میکروبی و ضد سرطانی می‌باشد.

جداسازی لاکتوفرین از شیر گاو :

این مطالعه در فاصله زمانی  ۱۳۸۸تا  ۱۳۸۹در مرکزتحقیقـات بیولـوژی سـلولی و مولکـولی دانـشگاه علـوم پزشـکی مازنـدران و پژوهـشکده ژنتیـک و تکنولـوژی زیستی کشاورزی طبرستان انجام گردید. کلـستروم شـیر گاو در طی  ۷۲ساعت پس از زایمان از  ۱۰راس گاو در ظروف استریل جمع‌آوری گردید و در شرایط دمـایی ۴ تا  ۶درجه سانتیگراد به مرکز تحقیقات بیولـوژی سـلولی و مولکولی منتقل شد. سپس به مدت ۲۰دقیقـه در دمـای  ۴درجـه سـانتیگراد و  ۱۰۰۰۰ xgسـانتریفیوژ گردیـد تـا خامه آن جدا شود. بعـد از جداسـازی خامـه، بـه منظـور جداسازی پروتئین کازئین، شیر پس چـرب(  (Skim milk به دست آمده را با استفاده از  ۲ HClنرمال به pH = 4/6 رسانده و به مدت  ۳۰دقیقه در داخل انکوباتور بـا دمـای  ۴۰درجه سـانتیگراد قـرار داده شـد. رسـوب کـازئین بـا سـانتریفیوژ از نمونـه هـا جـدا گردیـد. آب پنیـر اسـیدی(  (Acid wheyبدســت آمــده توســط   NaOHدو نرمــال خنثـی شـده و  pHآن بـه  ۶/۸رسـید.

جهـت جداسـازی گلوبولین‌ها از آب پنیر،  ۲۶۷ گرم آمونیـوم سـولفات بـه آرامی به یک لیتر از آب پنیر بدست آمده افزوده شـد و ســپس بــه مــدت  ۲۰دقیقــه در  ۱۰۰۰۰ × g در  ۴ درجــه سانتیگراد سانتریفیوژ گردید. رسوب حاصـل از پـروتئین گلوبولین دور ریخته شد و به مایع رویـی بـاقی مانـده بـه ازای هر لیتر  ۲۵۰ گرم سولفات آمونیوم افزوده گردید تا لاکتــوفرین‌هــا رســوب نماینــد. لاکتــوفرین‌هــا بوســیله سانتریفیوژ با شرایط قبلی جدا شدند. به منظور جداسازی نمک سولفات آمونیوم از پروتئین، عمل دیالیز با استفاده از کیـسه‌هـای دیـالیز بـا نقطـه بـرش  ۱۰ KDaدر دمـای  ۴درجـه سـانتیگراد و بـر روی هیتـر اسـتیرر بـا سـرعت  ۲۰۰ rpm/minبــه مــدت  ۲۴ســاعت در بــافر فــسفات  ۲۰میلی مولار انجام گرفت. سپس نمونه‌ها جهت تغلـیظ بیشتر به مـدت  ۲۴سـاعت در دسـتگاه فریـز درایـر قـرار گرفتند تا لاکتوفرین به صورت پودر در آید.

خـالص سـازی لاکتوفرین از شیر گاو بـا اسـتفاده از دسـتگاه  FPLC و سـتون CM-Sephadex- C50:

کروماتوگرافی لاکتوفرین یک پروتئین کاتیونی با  pHایزوالکتریـک بیشتراز  ۹میباشد کـه ایـن  pHایزوالکتریـک در فراینـد جداسـازی آن از ســایر پــروتئین‌هـای آب پنیــر کمــک شایانی می‌نمایـد.  PHایزوالکتریـک بـالا در لاکتـوفرین موجــب ایجــاد شــارژ مثبــت در  PHخنثــی در پــروتئین می‌گردد حال آنکه در این شـرایط بیـشتر پـروتئین‌هـای شیر اسیدی هستند. بنابراین ستون تبـادل کـاتیونی در  pH خنثی روش معمولی بـرای جداسـازی لاکتـوفرین از آب پنیــر حاصــل از شــیر اســت.

بــرای خــالص‌ســازی لاکتوفرین از دستگاه ( FPLCمدل  ،LPبیـورد آمریکـا) استفاده شد تا ستون‌های آن در مقایسه بـا  HPLCامکـان بــارگزاری مقــادیر بیــشتر پــروتیئن و اســتفاده از دامنــه گسترده‌تـر از بافرهـا را فـراهم سـازد. بـرای ایـن منظـور نمونه‌های پودر شده پروتئین در بافر فسفات  ۲۰میلی مـولار حل شده و سپس روی ستون  CM-sephadex-C50 برده شد.

ابتدا ستون با بافر فـسفات  ۲۰میلـی مـولار بـه تعـادل رسـید سـپس بعـد از ورود نمونـه، پـروتئین‌هـا در شـیب غلظت نمکی صفر تا  ۰/۵مولار توسـط بـافر خـروج کـه شامل بافر فسفات و   NaClیک مولار می‌باشـد از سـتون با سرعت  ۰/۷۵میلی لیتـر در دقیقـه تحـت فـشار ۵ MPa خارج گردید. پروتئین لاکتوفرین در مولاریتـه  ۰/۴تـا ۰/۵ نمک، خارج شد.

الکتروفورز در ژل پلـی اکریـل آمیـد در حـضور سـدیم دودسیل سولفات( SDS-PAGE):

جهت بررسی خلـوص لاکتـوفرین بدسـت آمـده از الکتروفورز  SDS-PAGEاستفاده شد )تانـک الکتروفـورز عمــــودی، ســــاخت شــــرکت بیــــورد  .(BioRadژل  SDS-PAGEبـــه صـــورت دو قـــسمتی، در بـــالا ژل متـــراکم کننـــده  ۵درصـــد و در پـــایین ژل جدا کننـــده  Running Gelد. درصد تهیه شـد. نمونـه‌هـای پروتئینـی در حـضور مـارکر انـدازه پروتئینـی در طـول ژل تحـت جریان الکتریسیته با ولتاژ  ۱۰۰ولت و به مـدت ۲سـاعت حرکت نموده و پـس از پایـان الکتروفـورز ژل بـا رنـگ کماسی بلو  R250رنگ آمیزی شده و پس از رنگ بریبـا محلـول رنـگ بـر (اتـانول+ اسـید اسـتیک) بانـدهای پروتئین آشکار گردیدند.

تعیین غلظت پروتئین با روش براد فورد :

پروتئین‌های خـالص شـده بـا اسـتفاده از روش بـراد فورد تعیین غلظت شدند. بدین منظور ابتـدا غلظـت‌هـایمتفاوتی از استاندارد ) (BSA پروتئین آلبومین گـاوی در  ۶لوله به صورت ذیـل تهیـه شـد: ابتـدا در هـر لولـه ۹۰۰ میکرولیتـر از محلـول برادفـورد(  (Brad fordریختـه و ســـپس بـــه آنهـــا مقـــادیر  ۲۵ ،۲۰ ،۱۵ ،۱۰ ،۵ ،۰و ۳۰ میکروگرم از پروتئین استاندارد  BSAاضافه شـد.۲ لولـه از غلظت‌های پروتئین خالص شده با دو حجم به ترتیـب  ۵و  ۳۰میکرولیتـر تهیـه شـد سـپس حجـم تمـام لولـه هـا توسط آب مقطر به  ۱میلیلیتر رسـانده شـد و لولـه هـا بـه طور یکسان مخلوط شـدند. خوانـدن جـذب نمونـه‌هـا از زمان  ۱۰دقیقه تا  ۱ساعت در  ۵۹۵ نانومتر انجام گرفت و غلظـت لاکتـوفرین خـالص شـده بـا اسـتفاده از منحنـی استاندارد  ۲/۵ µg/µlبه دست آمد.

خالص سازی لاکتوفرین از شیر گاو

به منظور خالص سازی لاکتوفرین ابتدا چربی شیر با استفاده از سانتریفیوژ جداسـازی شـد و سـپس اسـتخراج پروتئین‌های شیر طی دو مرحله صـورت گرفـت ابتـدا بـا رسـوب آمونیـوم سـولفات بخـشی از پـروتئین‌هـای شـیر جداسازی شدند. سـپس پـروتئین‌هـای باقی مانده تغلیظ شده حاوی لاکتوفرین را دیـالیز نمـوده و جهت خالصسازی بیشتر برروی ستون کروماتوگرافی تبادل کـاتیونی  CM- Sephadex-C50 بـرده شـدند.

فـاز استخراج شامل دو پیک اصلی است که پیک اول خـروج لاکتوپراکسیداز را نشان مـی‌دهـد کـه در غلظـت نمکـی پائین صورت گرفته و پیـک دوم مربـوط بـه لاکتـوفرین می‌باشد که در غلظت نمکی بالا ( ۵۰درصد) خارج شده است. با توجه به اینکه این دو پروتئین هم وزن می‌باشند ( 80KDa) و خصوصیات تقریبـاً مـشابهی دارنـد امـا در این نوع ستون کروماتوگرافی در غلظت نمکـی متفـاوت به راحتی از هـم قابـل تمـایز هـستند. پـروتئین‌هـای شـیر بــه ترتیــب بــا درصــدهای متفــاوت از غلظــت نمــک (۱مولار ) NaCl خارج گشته که در مولاریته  ۰/۴تـا ۰/۵ نمک، پروتئین لاکتوفرین از ستون خارج گردیـد. مراحل خالص سـازی و میـزان خـالص‌سـازی تعیین گردیـد. جهـت تائیـد پـروتئین فوق از الکتروفورز  SDS-PAGEبا ژل آکریل آمیـد ۱۰ درصــد اســتفاده شــد وجــود مــارکر وزن مولکــولی و لاکتوفرین استاندارد، باند لاکتوفرین مورد نظـر را تائیـد نمودند.

نمونـه‌هـای حـاوی لاکتـوفرین خـالص شـده در دستگاه لیوفیلیزه تغلیظ شده و غلظت آنها به روش بـراد فورد تعیین گردید. سرعت خروج بافر برای شستشوی ستون و اسـتخراج لاکتوفرین  ۰/۷۵ ml/minبود و لاکتـوفرین در غلظـت نمکی  ۰/۵مولار از ستون خارج گردید و بـه طـور کلـی مدت زمان خالص سازی  ۳ساعت بود.

محصولات شامل لاکتـوفرین

مطالعه حاضر با هدف جداسازی و افزایش خلـوص و غلظت لاکتوفرین از کلستروم شیر گاو جهـت اهـدافی نظیر ارزیابی خصوصیات ضد میکروبی و ضـد تومـوری انجام گردید. امروزه غـذای کودکـان بـا فرمـول حـاوی لاکتوفرین گاوی در کـشورهای ژاپـن، کـره وانـدونزی فروخته می‌شود.

محصولات دیگری که شامل لاکتـوفرین گــاوی مــی‌باشــند از جملــه:

ماســت، شــیر پــر چــرب، قرص‌های مکمل، غذای حیوانات، کودکان و محـصولات آرایشی هستند.

تخمین زده شـده کـه تولیـد لاکتـوفرین تنها توسـط یـک کمپـانی در سـال  ۲۰۰۳حـدود  ۷۹تـن بــوده اســت کــه اهمیــت تولیــد ایــن پــروتئین را نــشان می‌دهد. مراحل خالص‌سازی لاکتوفرین با استفاده از ستون‌های کرومـاتوگرافی متنـوع از جملـه کرومـاتوگرافی تمایلی  (Affinity) و تبادل یونی (Ion exchange) قابـل انجام می‌باشد که تنها در نوع اول مـی‌توانـد بـه صـورت تک مرحله‌ای خـالص‌سـازی صـورت گیـرد و در سـایر موارد خالص‌سازی به مراحل دوم یعنی استفاده از سـتون ژل فیلتراسیون منجر خواهد شد. هر چند خـالص سـازی لاکتوفرین با استفاده از کروماتوگرافی تمـایلی بـه صـورت تک مرحله‌ای قابل جداسازی می‌باشـد امـا عـدم مزیـت این روش در این است که معمولاً پروتئین خـالص شـده غیر فعال می‌باشد که باید توسط روش‌هـای فعـال‌سـازی مجدداً فعال گردد.

از جمله کروماتوگرافی‌هـای تمـایلی برای خالص‌سازی لاکتوفرین،  DNA و هپارین و همچنـین متال (مس) کروماتوگرافی تمایلی است که بعـد از آن نیـاز به کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون برای خالص‌سازی نهـایی مـی‌باشـد. اسـتفاده از هپـارین سـفاروز کرومـاتوگرافی تمایلی برای خالص‌سازی لاکتوفرین انسانی نیز گـزارش شده است. لاکتوفرین یک پروتئین کاتیونی (بار مثبت) است که می‌تواند توسـط کرمـاتوگرافی تعـویض یونی خالص‌سازی گـردد بـا توجـه بـه طبیعـت کـاتیونی لاکتوفرین یکی از رایج‌ترین روش خالص‌سازی استفاده از ســتون تبــادل کــاتیونی از جملــه کربوکــسی متیــل سـفادکس اسـت کـه در مطالعـه حاضـر مـورد اسـتفاده قرار گرفته کـه نتـایج حاصـل از ایـن روش بـا توجـه بـه تــک مرحلــه‌ای شــدن خــالص‌ســازی قابــل مقایــسه بــاکرومـاتوگرافی‌هـای تمـایلی انجـام شـده مـی‌باشـد. در گزارش‌های موجود (از خالص سازی لاکتوفرین با منـشا انسانی، گاوی و شـتر) مرتبـه خـالص سـازی و بـازده آن ناچیز بوده است.

یافتـــه‌هـــای حاصـــل از الکتروفـــوز :

خلـوص بـالای ایـن پـروتئین بعـد از تنهـا یـک مرحلـه خالص‌سازی را تایید می‌نماید. این یافته با مطالعات سایر محققین همراسـتا مـی‌باشـد. نکتـه جالـب در ایـن مطالعه راندمان نـسبتاً بـالای فراینـد تخلـیص لاکتـوفرین می‌باشد به طوریکه میـزان لاکتـوفرین بدسـت آمـده از یک لیتر شیر گاو حـدود  ۲/۴ mg/mlمـی‌باشـد. ایـن در حـالی اسـت کـه در مطالعـات قبلـی غلظـت لاکتـوفرین اتحصال شده از کلستروم شیر گاو  ۰/۱تا  ۰/۴میلـی گـرم در میلی لیتـر گـزارش شـده اسـت. ایـن اخـتلاف معنیدار می‌تواند مربوط به روش جداسازی و خالص‌سازی و بهینه سازی این روش و همچنین دقـت در عمـل باشـد.

در این مطالعه از کلسترم شیر گاوهایی اسـتفاده شـد کـه حداکثر  ۷۲ساعت از زایمان آنها می‌گذشت کـه خـود سرشار از انواع پـروتین‌هـای متـراکم شـده مـی‌باشـد در حالی که در سایر مطالعات جداسازی از شیر معمولی گاو انجام شده است. از طـرف دیگـر یافتـه‌هـای ایـن مطالعـه نــشان داد کــه اســتفاده از FPLCجهــت خــالص‌ســازی لاکتوفرین در مواقعی که محتوای پروتیئنی نمونـه بـسیار چشمگیر می‌باشد، می‌تواند بر سایر روش‌های جداسازی نظیر  HPLC برتری داشته باشد. این استنتاج از آنجا منشا می‌گیرد کـه سـتون‌هـای تبـادل کـاتیونی مبتنـی بـر بارگذاری مقادیر زیـاد پـروتیئن بکـار رفتـه در ، FPLC شرایط لازم برای خالص‌سازی را به نحـو مطلـوب فـراهم خواهد آورد.